MicroRNA-146在糖尿病心肌病中的調(diào)控作用*

楊開雯， 強 鄭， 靳貝芳， 靳文雨， 劉 昉△

(1桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院解剖教研室， 廣西 桂林 541004; 2信陽職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院， 河南 信陽 464000)

糖尿病是當今威脅人類健康的重大疾病，超過1/3的糖尿病患者已有嚴重的并發(fā)癥，嚴重威脅著人類生命安全和生活質(zhì)量。研究表明，合并心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的糖尿病患者致死率增加 2 倍以上[1],其中糖尿病心肌損傷是糖尿病心血管并發(fā)癥的重要組成部分。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是獨立于高血壓、缺血和心臟瓣膜疾病所導致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的心肌病，最終臨床表現(xiàn)為充血性心力衰竭、心源性休克以及猝死[2]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種長度為18～25個核苷酸的小分子，通過調(diào)節(jié)目標信使RNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因的表達。有數(shù)據(jù)顯示，miRNAs參與30%～50%基因的表達調(diào)控[3-4]。近年來的研究顯示心臟高豐度表達的miRNAs在各種心臟病的發(fā)病機制中扮演著重要角色。miR-146家族有miR-146a和miR-146b 2種，分別位于不同的染色體，在3’端“非種子區(qū)”有2個堿基不同。本研究擬探討miR-146a和miR-146b在糖尿病導致的心肌損傷過程中的調(diào)控作用，以及其下游靶基因免疫調(diào)節(jié)相關分子TNF受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)和白細胞介素1受體相關激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)在糖尿病心肌損傷中表達情況，試圖從miRNAs的角度尋找新的糖尿病心肌病變的發(fā)病機制和治療方案。

材 料 和 方 法

1 動物分組與處理

SPF級雄性C57BL/6小鼠60 只，體質(zhì)量約(19.00±3.67)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為 SCXK(湘)2016-0002。所有實驗小鼠在桂林醫(yī)學院動物實驗中心適應性喂養(yǎng) 1周后，隨機分為對照(control)組和糖尿病心肌病(DCM)組,每組30只，其中DCM組小鼠采用10 mmol/L鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma-Aldrich)連續(xù)5 d腹腔注射并且給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)制作1型糖尿病模型，注射劑量為50 mg/kg； control 組則注射同等劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。注射1周后，尾靜脈取血測量各組血糖水平。根據(jù)相關文獻，嚙齒類動物血漿葡萄糖濃度>16.7 mmol/L可認為糖尿病模型造模成功。每周監(jiān)測隨機血糖和體質(zhì)量，并密切觀察所有小鼠的基本情況。造模成功后 12 周末，對小鼠進行1次性腹腔注射 3%戊巴比妥鈉麻醉，開胸取出心臟，一部分做成蠟塊用于石蠟切片，另外一部分保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)的RT-qPCR及Western blot檢測實驗。

2 方法

2.1HE和Masson染色 (1)HE染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇水化；蘇木素液染色 5 min 后，流水沖洗 1～3 min；然后加 1%鹽酸乙醇 2 s，流水沖洗 3～5 min；伊紅染液復染 30 s 后脫水；最后用中性樹膠封片； (2)Masson染色切片脫蠟至水，Masson 復合染液滴染 2 min，0.2%冰醋酸洗 3 次，共 1 min；0.1%磷鎢酸分化 4 min，0.2%冰醋酸溶液洗 3 次，共1 min；亮綠染液染 1 min，0.2%冰醋酸洗 3 次，共 1 min，95%乙醇脫水 1 min，無水乙醇脫水 1 min，環(huán)保透明劑浸泡 5 min，最后用中性樹膠封片； (3)圖像分析：采用生物顯微鏡軟件拍照，心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色條索狀或均質(zhì)結(jié)構(gòu)，位于細胞間隙。采用ImageJ程序軟件進行圖像分析，膠原纖維染色面積占組織切片總面積的比例為膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)。

2.2RT-qPCR檢測miR-146a和miR-146b及心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)、IRAK1和TRAF6 mRNA的表達 從-80 ℃冰箱中取出保存的約 50 mg 小鼠心肌組織，按照 TRIzol(Invitrogen)法提取 RNA，用 NanoDrop 2000 分光光度儀(NanoDrop)檢測 RNA 純度和濃度。以 RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)進行逆轉(zhuǎn)錄， 利用SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒(TOYOBO)檢測miR-146a和miR-146b的表達水平及ANP、β-MHC、IRAK1和TRAF6 的mRNA 表達水平，其中， miR-146a和miR-146b以U6為內(nèi)參照，反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴增引物購于RiboBio；ANP、β-MHC、 IRAK1及TRAF6以GAPDH為內(nèi)參照，應用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，PCR引物購于Sangon Biotech。各基因引物序列采用 Prmier 3.0設計,見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

2.3Western blot檢測小鼠心肌組織中IRAK1及TRAF6的蛋白表達 將小鼠心臟加入RIPA 裂解液(Santa Cruz)，勻漿、離心后獲得總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，使用 SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉后，分別加入抗IRAK1 (Cell Signaling Technology)、TRAF6(Abcam)和β-tubulin(Cell Signaling Technology)的I抗，4 ℃孵育12 h；TBST 洗滌后，加入II抗(中杉金橋)，室溫下孵育 60 min，ECL顯色法顯色，X線片曝光檢測IRAK1和TRAF6的蛋白水平表達。

3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 13.0 進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，2組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 小鼠代謝指標的變化

與control組比較， DCM組小鼠的血糖值穩(wěn)步上升，并趨于穩(wěn)定在高血糖范圍(P=0.0011)，見圖1A；DCM組小鼠體重在建模早期與control組無明顯差異，8周后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(P=0.0039),見圖1B；DCM組小鼠心臟重量與control組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1C。我們進一步檢測了心肌肥大的標志性因子ANP和β-MHC的mRNA表達情況，結(jié)果顯示與control組相比，DCM組小鼠心肌組織中的ANP及β-MHC的mRNA水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

Figure 1.Blood glucose (A), body weight (B) and heart weight (C) in control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 2.The mRNA levels of ANP and β-MHC in the heart of control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 小鼠心臟的病理變化

第 12周末小鼠心臟的 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組相比，DCM 組小鼠部分心肌細胞肥大，心肌結(jié)構(gòu)紊亂，成纖維細胞明顯增多,見圖3。Masson 染色可見心肌纖維為暗紅色，而膠原纖維為深藍色，control組小鼠間質(zhì)膠原纖維較少，且主要分布于大血管壁周圍，DCM 組心肌內(nèi)血管壁周圍膠原纖維增多，在心肌細胞間隙內(nèi)也出現(xiàn)大量膠原纖維，DCM組CVF較control組顯著升高(P=0.0257),見圖4。

3 小鼠心肌組織中miR-146的表達

RT-qPCR檢測miR-146a及miR-146b的水平,結(jié)果表明，與control組相比，DCM組小鼠心肌組織中miR-146a及miR-146b的表達均顯著減少(P<0.01),見圖5。

Figure 3.The cardiac pathological changes of control group and DCM group observed by HE staining (×20).

4 TRAF6及IRAK1 mRNA和蛋白表達的變化

RT-qPCR結(jié)果顯示，與control組相比，DCM組TRAF6的mRNA表達顯著降低，而IRAK1的mRNA表達顯著增高(P<0.01或P<0.05),見圖6。Western blot 檢測TRAF6和IRAK1的蛋白表達水平與mRNA水平的變化趨勢一致，與control組相比，DCM組小鼠心臟的TRAF6蛋白表達顯著降低，IRAK1的蛋白表達顯著增加(P<0.05)，見圖7。

Figure 4.The cardiac pathological changes of control group and DCM group observed by Masson staining (×20). Mean±SD. n=6. * P<0.05 vs control group.

討 論

在目前的研究中，STZ常用于破壞胰腺細胞，構(gòu)建糖尿病模型，這種實驗性糖尿病模型能夠在很長一段時間內(nèi)保持穩(wěn)定，死亡率較低[5]；此外，這種模型在短時間內(nèi)很容易誘發(fā)1型糖尿病，與非肥胖糖尿病患者[6]的糖尿病非常相似。在本研究中，空腹血糖的研究結(jié)果與之前的實驗結(jié)果一致[7-8]，并證實了1型糖尿病的誘導成功。另外心肌細胞肥大相關基因ANP和β-MHC的mRNA表達顯著升高，符合體外研究動物糖尿病心肌病早期心肌細胞肥大的病理特征及心肌病理變化的動態(tài)過程[9]，說明糖尿病實驗組小鼠心臟出現(xiàn)了心肌肥大等糖尿病心肌損傷的典型癥狀。

Figure 5.The expression of miR-146a and miR-146b in the heart of control group and DCM group detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=6. ** P<0.01 vs control group.

Figure 6.The mRNA levels of TRAF6 and IRAK1 in the mouse myocardium of control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

非編碼RNA尤其是miRNAs是轉(zhuǎn)錄后基因表達的主要調(diào)控因子，多數(shù)情況下與信使RNA的3’-UTR結(jié)合，通過降解信使RNA或抑制轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控基因的表達[10]，一些特殊的miRNAs參與糖尿病的慢性并發(fā)癥[11-14]，如在先前的研究中，miR-146a在糖尿病腎[15]和糖尿病患者[16-17]的血漿和角膜上皮組織表達增加，在糖尿病大鼠的主動脈和坐骨神經(jīng)[18-19]中表達下調(diào)；miRNA-146b在人和小鼠的心肌炎[20]和自發(fā)性心肌肥大和心衰小鼠[21]的心臟中表達上調(diào)。

Figure 7.The protein levels of TRAF6 and IRAK1 in the mouse myocardium of control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group.

2型糖尿病與慢性低水平炎癥的相關性具有典型性，miR-146在2型糖尿病患者血清中表達減少被認為是慢性炎癥的標志[22]。但是在1型糖尿病中，根據(jù)胰腺組織的損傷情況來看，這種炎癥反應很可能也存在于1型糖尿病中[23-25]。根據(jù)文獻報道，TRAF6和IRAK1為miR-146的靶基因[26]，miR-146可以通過結(jié)合下游靶基因特定的3’-UTR來調(diào)節(jié)基因的表達，而且TRAF6和IRAK1是炎癥調(diào)控相關因子，在糖尿病心肌病的發(fā)病過程中也可能起重要作用。本研究中，糖尿病實驗組小鼠心臟中的miR-146a和miR-146b表達均顯著降低，這很可能是1型糖尿病小鼠心臟出現(xiàn)慢性炎癥的一個標志。本實驗中，糖尿病實驗組小鼠心肌組織中TRAF6表達較control組顯著降低，而IRAK1的表達顯著升高。IRAK1為白細胞介素受體相關激酶，是促炎癥因子，也是TLR/IL1R炎癥信號通路的主要介質(zhì)，參與IL-1誘導的NF-κB上調(diào)調(diào)控通路，在吳鏗等[27]的研究中， DCM能上調(diào)TLR4表達。本研究中，糖尿病心肌病小鼠miR-146表達降低，而IRAK1的表達明顯升高，因此在糖尿病心肌病小鼠心肌組織中miR-146對IRAK1可能也存在負調(diào)控作用。也有報道顯示miR-146可以通過抑制Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)信號通路調(diào)節(jié)Th1[28]細胞以應對炎癥刺激。TRAF6也是NF-κB信號通路中的轉(zhuǎn)導因子，但是在本實驗結(jié)果中TRAF6的表達水平降低，這可能與炎癥反應調(diào)控的時點有關，這提示，在心臟中miR-146可能只調(diào)控IRAK1的表達，TRAF6可能受到其它miRNAs的負向調(diào)控。在有關干燥綜合征的研究中，miR-146也只是負反饋調(diào)節(jié)IRAK1，對TRAF6的調(diào)控不明顯[29]，這與我們的研究結(jié)果類似。 關于糖尿病心肌病的炎癥網(wǎng)絡調(diào)控機制還有待深入研究。

總之，目前的研究結(jié)果表明miR-146參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展，另外，在2型糖尿病中，miR-146被認為是炎癥反應的血清標志物，這也顯示了miR-146及其下游信號導致糖尿病的慢性炎癥和胰島素抵抗。細胞培養(yǎng)和動物模型表達的研究，將有助于確定miR-146的確切作用，以及它與糖尿病炎癥和胰島素抵抗的相關性。血清可檢測到的microRNA可能為疾病檢測、監(jiān)測和個性化藥物提供一種潛在的非侵入性措施。未來的研究將證明，在增強miR-146表達或調(diào)節(jié)miR-146信號時，能夠改變糖尿病心肌病變中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減少炎癥和胰島素敏感性的作用，以防止糖尿病心臟發(fā)生炎癥變化。