原兒茶酸對(duì)金黃色葡萄球菌性肺炎模型小鼠的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

饒春暉 陸淼炯 楊 燕

肺炎在全球具有較高的發(fā)生率和病死率，是兒童死亡的重要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010—2011年有超過(guò)100萬(wàn)兒童死于肺炎[1]。金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是分布極為廣泛的感染性病原體之一，SA能夠引起包括菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染、骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、肺部感染（如肺炎和膿胸）、腦膜炎、中毒性休克綜合征和尿路感染等感染性疾病[2-3]。經(jīng)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在SA引起的所有感染性疾病中，肺炎發(fā)病率位居第二，并伴隨高死亡率[4]。原兒茶酸（protocatechuic acid，PA），是一種常見(jiàn)的酚酸類化合物，也是人類日常飲食中常見(jiàn)的化合物，存在于多種食用植物中[5]，臨床上主要用于治療慢性氣管炎。目前研究[6-9]發(fā)現(xiàn)，PA還具有抗氧化、抗菌抗癌、抗?jié)?、降糖、抗老化、抗纖維化、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣道滴注建立SA肺炎模型小鼠，觀察PA是否對(duì)SA肺炎小鼠具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步通過(guò)RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PA保護(hù)作用的可能機(jī)制，希望為SA肺炎的臨床治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6雌鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量16～20g，購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。RAW264.7細(xì)胞由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 試劑及儀器 原兒茶酸于阿拉丁試劑官網(wǎng)訂購(gòu)（批號(hào)P104383，規(guī)格250mg）。金黃色葡萄球菌（杭州市中醫(yī)院提供）。異戊巴比妥鈉（批號(hào)20180102）、小鼠白介素 6（interleukin-6，IL-6）（批號(hào)4313607）和小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批號(hào) 169143001）ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于美國(guó)Ebioscience公司。兔抗鼠多克隆抗體p38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）（批號(hào) 9212S）和磷酸化（p）-P38MAPK（批號(hào) #9215S）、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK MAPK）（批號(hào) #9102）和 p-ERK MAPK（批號(hào) #4370S）、c-Jun氨基末端激酶 （c-Jun N-terminal kinase，JNK MAPK）（批號(hào) #9258） 和 p-JNK MAPK（批號(hào)4668S）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65 （nuclear factor κB P65，P65）（批號(hào) 8242S）和 p-P65（批號(hào) 3033S）（Cell Signaling Technology公司，美國(guó)）、總RNA提取試劑盒（批號(hào)07062018）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)19122019）、熒光定量 PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)26122019）均購(gòu)置于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Western Blot電泳儀（BIO-RAD，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，日本）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SA菌體培養(yǎng) 取一管金黃色葡萄球菌凍存液，室溫解凍后，吸取加至50mL無(wú)菌離心管中，含經(jīng)高壓滅菌的10mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptic soy broth，TSB），放于 37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，隨后從中吸取100μL加入至新鮮無(wú)菌的10mL TSB液體培養(yǎng)基中，搖菌4h，離心后加無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸備用。

2.2 小鼠SA肺炎模型建立 小鼠隨機(jī)分籠，并在無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食進(jìn)水飼養(yǎng)，待小鼠適應(yīng)2～3天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和PA干預(yù)組，各12只。以12μL/1g體質(zhì)量的1.5%異戊巴比妥鈉溶液量對(duì)小鼠行腹腔注射麻醉，對(duì)模型組小鼠和PA干預(yù)組小鼠麻醉后行氣道滴注金黃色葡萄球菌，菌量為5×107菌落形成單位（colony-forming units，CFU），其中 PA 干預(yù)組小鼠麻醉前1h腹腔注射0.2mL PA（30mg/kg）；對(duì)照組小鼠行氣道滴注等量的無(wú)菌PBS。

2.3 細(xì)胞感染模型建立 RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和PA干預(yù)組進(jìn)行鋪板。對(duì)照組：RAW264.7細(xì)胞置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×105/mL的密度鋪于6孔板中；模型組：RAW264.7細(xì)胞計(jì)數(shù)后，培養(yǎng)過(guò)夜至細(xì)胞貼壁，滴加菌量為1×107CFU的SA刺激細(xì)胞；PA干預(yù)組：RAW264.7細(xì)胞計(jì)數(shù)后，培養(yǎng)過(guò)夜至細(xì)胞貼壁，滴加PA（50μM）預(yù)處理1h，加菌量為1×107CFU的SA刺激細(xì)胞。

2.4 小鼠肺組織病理檢測(cè) 小鼠感染12h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取4只小鼠，斷頸處死并固定，解剖小鼠打開(kāi)胸腔，小心取出全肺，浸放于4%多聚甲醛中固定，送谷歌生物公司常規(guī)制備石蠟切片并行蘇木精伊紅染色方法（hematoxylineosin staining，HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺部病灶形態(tài)變化。

2.5 小鼠肺泡灌洗液（BALF）抽取 小鼠感染12h后，斷頸處死于70%酒精浸泡后，固定在解剖板上，打開(kāi)胸腔，暴露氣管和肺組織，吸取0.8mL無(wú)菌的PBS緩慢沖洗肺組織3次，回收支氣管肺泡灌注液（BALF），回收率均在80%以上，回收的肺泡灌洗液于-80℃保存?zhèn)溆没虮洗娣努F(xiàn)用，用于炎癥因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2.6 RT-PCR檢測(cè) 使用RNA提取試劑盒分別提取各組小鼠肺組織勻漿和RAW264.7細(xì)胞總RNA，濃度測(cè)定后進(jìn)行定量，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，在mRNA水平檢測(cè)所有樣本TNF-α和IL-6的表達(dá)，引物信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的引物序列

2.7 ELISA檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)，依次收取三組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)各組小鼠肺泡灌洗液BALF和細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6表達(dá)水平。

2.8 Western Blot檢測(cè) 在 SA 刺激 15、30、60和120min四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集各組RAW264.7細(xì)胞至1.5mL EP管中，加入細(xì)胞裂解液后在冰上裂解30min 后，4°C 12 000r/min 離心 10min，并依照二聯(lián)喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。每組蛋白樣本加上樣緩沖液后100°C水浴5min使蛋白變性，而后進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后，封閉液室溫緩慢搖床封閉2h，加入p38MAPK和p-p38MAPK、ERK MAPK和p-ERK MAPK、JNK MAPK 和 p-JNK MAPK、P65和p-P65多克隆抗體4°C孵育過(guò)夜?；厥找豢梗覲BST緩沖液洗膜10min，重復(fù)3次，加二抗室溫?fù)u床上緩慢孵育1.5h，加PBST緩沖液洗膜10min，重復(fù)3次，膜上滴加ECL發(fā)光液，待鋪滿PVDF膜，即可曝光并分析各蛋白表達(dá)情況。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析和作圖應(yīng)用GraphPad軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三組小鼠肺組織病理改變 光鏡下HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡數(shù)量豐富，支氣管結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，血管和支氣管外均可見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（封四圖1綠色箭頭所示）；肺泡壁增厚，其中散布有淋巴細(xì)胞（封四圖1黑色箭頭所示）；支氣管管腔中可見(jiàn)紅細(xì)胞（封四圖1黃色箭頭所示）；血管管腔內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞貼壁（封四圖1紅色箭頭所示）；PA預(yù)處理組小鼠肺組織損傷程度較模型組顯著減輕，局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分肺泡結(jié)構(gòu)清晰，見(jiàn)封四圖1。

3.2 三組小鼠肺泡灌洗液和肺組織TNF-α和IL-6表達(dá)水平比較 SA感染小鼠后，小鼠BALF液炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)和小鼠肺組織勻漿TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P均＜0.05）；PA預(yù)處理后，能顯著抑制TNF-α和IL-6表達(dá)（P均＜0.05）。見(jiàn)封四圖 2。

3.3 三組上清液和細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)水平比較 SA刺激細(xì)胞后，細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6表達(dá)和細(xì)胞裂解后TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P均＜0.05）；PA預(yù)處理后，能顯著抑制TNF-α和IL-6表達(dá)（P均＜0.05），見(jiàn)封四圖3。

3.4 PA對(duì)RAW264.7細(xì)胞相關(guān)炎癥信號(hào)通路的影響 SA刺激能引起P38、ERK、JNK和P65蛋白顯著活化，PA預(yù)處理明顯抑制P65蛋白活化，但對(duì)P38、ERK和JNK的活化無(wú)抑制作用，顯示PA預(yù)處理可以抑制SA誘導(dǎo)的P65炎癥信號(hào)通路激活。見(jiàn)封三圖4。

4 討論

SA是人類最常見(jiàn)的化膿感染性病原體，當(dāng)SA感染機(jī)體后釋放一系列毒素和侵襲性酶，會(huì)引發(fā)局部性化膿感染，也可引起包括心包炎、肺炎、敗血癥、膿毒癥等致死性疾病[10-13]。臨床數(shù)據(jù)[14-15]顯示，金葡菌肺炎在全球已經(jīng)十分普遍，并且伴隨著較高的死亡率，這對(duì)人類的身心健康造成極大的挑戰(zhàn)。SA作為T(mén)oll樣受體信號(hào)通路配基能特異性結(jié)合細(xì)胞膜上的TLR2受體，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括誘導(dǎo)TNF-α和IL-6等炎癥因子釋放，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并引起中性粒細(xì)胞募集，在急性肺炎中發(fā)揮重要的作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組小鼠比較，SA可顯著提高肺組織炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)小鼠肺部病理學(xué)損傷，顯示SA肺炎模型建立成功。SA感染宿主后，促進(jìn)機(jī)體釋放大量炎癥因子，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生病理學(xué)改變[17-18]。PA常見(jiàn)于人類食用植物中，能被人體吸收，研究[19]發(fā)現(xiàn)，PA具有良好的抗炎生物學(xué)活性。本研究結(jié)果顯示，SA感染小鼠后，小鼠BALF液炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)和小鼠肺勻漿TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P均＜0.05）；SA刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7后，細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6表達(dá)和細(xì)胞裂解后的TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P均＜0.05）；PA可顯著抑制肺組織和巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)（P均＜0.05），減輕小鼠肺部病理學(xué)損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PA可能通過(guò)抑制炎癥因子的釋放改善肺組織病理?yè)p傷。

MAPK和NF-κB信號(hào)通路是近年來(lái)研究極為廣泛的炎癥信號(hào)通路，MAPK家族包括P38 MAPK、ERK MAPK和JNK MAPK三個(gè)亞家族，已有研究[20-21]報(bào)道MAPK在急性炎癥應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用，是參與應(yīng)激過(guò)程中調(diào)控多種基因表達(dá)的重要介質(zhì)。NF-κB參與免疫和炎癥反應(yīng)早期過(guò)程炎癥因子表達(dá)的調(diào)控，包括激活多種炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等[22]。

由于 TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子主要由細(xì)菌毒素等物質(zhì)作用的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生[3]，加上小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，影響因素較多，而細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)傳導(dǎo)變化較快，故為進(jìn)一步深入研究PA作用的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)，PA提前干預(yù)的方法進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SA刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7后p-ERK、p-JNK、p-P38和p-P65的表達(dá)明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PA提前干預(yù)之后p-ERK、p-JNK和p-P38的表達(dá)與模型組一致，而P65磷酸化較模型組明顯減輕。提示PA對(duì)SA肺炎小鼠的保護(hù)機(jī)制可能與抑制P65蛋白的過(guò)度磷酸化有關(guān)，因此我們推測(cè)PA抑制炎癥而減輕SA肺炎，可能與抑制P65信號(hào)通路激活相關(guān)，至于PA是通過(guò)何種途徑抑制P65信號(hào)通路激活有待進(jìn)一步探討。