饒春暉 陸淼炯 楊 燕
肺炎在全球具有較高的發(fā)生率和病死率,是兒童死亡的重要原因,據(jù)統(tǒng)計(jì),2010—2011年有超過100萬兒童死于肺炎[1]。金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SA)是分布極為廣泛的感染性病原體之一,SA能夠引起包括菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染、骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、肺部感染(如肺炎和膿胸)、腦膜炎、中毒性休克綜合征和尿路感染等感染性疾病[2-3]。經(jīng)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),在SA引起的所有感染性疾病中,肺炎發(fā)病率位居第二,并伴隨高死亡率[4]。原兒茶酸(protocatechuic acid,PA),是一種常見的酚酸類化合物,也是人類日常飲食中常見的化合物,存在于多種食用植物中[5],臨床上主要用于治療慢性氣管炎。目前研究[6-9]發(fā)現(xiàn),PA還具有抗氧化、抗菌抗癌、抗?jié)儭⒔堤?、抗老化、抗纖維化、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)通過氣道滴注建立SA肺炎模型小鼠,觀察PA是否對SA肺炎小鼠具有保護(hù)作用,并進(jìn)一步通過RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PA保護(hù)作用的可能機(jī)制,希望為SA肺炎的臨床治療提供新的思路。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6雌鼠36只,6~8周齡,體質(zhì)量16~20g,購自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2013-0016。RAW264.7細(xì)胞由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。
1.2 試劑及儀器 原兒茶酸于阿拉丁試劑官網(wǎng)訂購(批號(hào)P104383,規(guī)格250mg)。金黃色葡萄球菌(杭州市中醫(yī)院提供)。異戊巴比妥鈉(批號(hào)20180102)、小鼠白介素 6(interleukin-6,IL-6)(批號(hào)4313607)和小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(批號(hào) 169143001)ELISA 檢測試劑盒購置于美國Ebioscience公司。兔抗鼠多克隆抗體p38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)(批號(hào) 9212S)和磷酸化(p)-P38MAPK(批號(hào) #9215S)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK MAPK)(批號(hào) #9102)和 p-ERK MAPK(批號(hào) #4370S)、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK MAPK)(批號(hào) #9258) 和 p-JNK MAPK(批號(hào)4668S)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65 (nuclear factor κB P65,P65)(批號(hào) 8242S)和 p-P65(批號(hào) 3033S)(Cell Signaling Technology公司,美國)、總RNA提取試劑盒(批號(hào)07062018)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)19122019)、熒光定量 PCR檢測試劑盒(批號(hào)26122019)均購置于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Western Blot電泳儀(BIO-RAD,美國),光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,日本)等。
2.1 SA菌體培養(yǎng) 取一管金黃色葡萄球菌凍存液,室溫解凍后,吸取加至50mL無菌離心管中,含經(jīng)高壓滅菌的10mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Tryptic soy broth,TSB),放于 37℃搖床過夜培養(yǎng),隨后從中吸取100μL加入至新鮮無菌的10mL TSB液體培養(yǎng)基中,搖菌4h,離心后加無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)重懸備用。
2.2 小鼠SA肺炎模型建立 小鼠隨機(jī)分籠,并在無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食進(jìn)水飼養(yǎng),待小鼠適應(yīng)2~3天后開始實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為對照組、模型組和PA干預(yù)組,各12只。以12μL/1g體質(zhì)量的1.5%異戊巴比妥鈉溶液量對小鼠行腹腔注射麻醉,對模型組小鼠和PA干預(yù)組小鼠麻醉后行氣道滴注金黃色葡萄球菌,菌量為5×107菌落形成單位(colony-forming units,CFU),其中 PA 干預(yù)組小鼠麻醉前1h腹腔注射0.2mL PA(30mg/kg);對照組小鼠行氣道滴注等量的無菌PBS。
2.3 細(xì)胞感染模型建立 RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組和PA干預(yù)組進(jìn)行鋪板。對照組:RAW264.7細(xì)胞置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×105/mL的密度鋪于6孔板中;模型組:RAW264.7細(xì)胞計(jì)數(shù)后,培養(yǎng)過夜至細(xì)胞貼壁,滴加菌量為1×107CFU的SA刺激細(xì)胞;PA干預(yù)組:RAW264.7細(xì)胞計(jì)數(shù)后,培養(yǎng)過夜至細(xì)胞貼壁,滴加PA(50μM)預(yù)處理1h,加菌量為1×107CFU的SA刺激細(xì)胞。
2.4 小鼠肺組織病理檢測 小鼠感染12h后,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取4只小鼠,斷頸處死并固定,解剖小鼠打開胸腔,小心取出全肺,浸放于4%多聚甲醛中固定,送谷歌生物公司常規(guī)制備石蠟切片并行蘇木精伊紅染色方法(hematoxylineosin staining,HE)染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺部病灶形態(tài)變化。
2.5 小鼠肺泡灌洗液(BALF)抽取 小鼠感染12h后,斷頸處死于70%酒精浸泡后,固定在解剖板上,打開胸腔,暴露氣管和肺組織,吸取0.8mL無菌的PBS緩慢沖洗肺組織3次,回收支氣管肺泡灌注液(BALF),回收率均在80%以上,回收的肺泡灌洗液于-80℃保存?zhèn)溆没虮洗娣努F(xiàn)用,用于炎癥因子檢測實(shí)驗(yàn)。
2.6 RT-PCR檢測 使用RNA提取試劑盒分別提取各組小鼠肺組織勻漿和RAW264.7細(xì)胞總RNA,濃度測定后進(jìn)行定量,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR檢測試劑盒,在mRNA水平檢測所有樣本TNF-α和IL-6的表達(dá),引物信息見表1。
表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測的引物序列
2.7 ELISA檢測 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng),依次收取三組細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測各組小鼠肺泡灌洗液BALF和細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6表達(dá)水平。
2.8 Western Blot檢測 在 SA 刺激 15、30、60和120min四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集各組RAW264.7細(xì)胞至1.5mL EP管中,加入細(xì)胞裂解液后在冰上裂解30min 后,4°C 12 000r/min 離心 10min,并依照二聯(lián)喹啉酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度檢測試劑盒要求進(jìn)行蛋白濃度測定。每組蛋白樣本加上樣緩沖液后100°C水浴5min使蛋白變性,而后進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分離蛋白,轉(zhuǎn)膜后,封閉液室溫緩慢搖床封閉2h,加入p38MAPK和p-p38MAPK、ERK MAPK和p-ERK MAPK、JNK MAPK 和 p-JNK MAPK、P65和p-P65多克隆抗體4°C孵育過夜。回收一抗,加PBST緩沖液洗膜10min,重復(fù)3次,加二抗室溫?fù)u床上緩慢孵育1.5h,加PBST緩沖液洗膜10min,重復(fù)3次,膜上滴加ECL發(fā)光液,待鋪滿PVDF膜,即可曝光并分析各蛋白表達(dá)情況。
2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析和作圖應(yīng)用GraphPad軟件,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 三組小鼠肺組織病理改變 光鏡下HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡數(shù)量豐富,支氣管結(jié)構(gòu)完整;模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,血管和支氣管外均可見較多淋巴細(xì)胞浸潤(封四圖1綠色箭頭所示);肺泡壁增厚,其中散布有淋巴細(xì)胞(封四圖1黑色箭頭所示);支氣管管腔中可見紅細(xì)胞(封四圖1黃色箭頭所示);血管管腔內(nèi)可見淋巴細(xì)胞貼壁(封四圖1紅色箭頭所示);PA預(yù)處理組小鼠肺組織損傷程度較模型組顯著減輕,局灶性炎性細(xì)胞浸潤,大部分肺泡結(jié)構(gòu)清晰,見封四圖1。
3.2 三組小鼠肺泡灌洗液和肺組織TNF-α和IL-6表達(dá)水平比較 SA感染小鼠后,小鼠BALF液炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)和小鼠肺組織勻漿TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05);PA預(yù)處理后,能顯著抑制TNF-α和IL-6表達(dá)(P均<0.05)。見封四圖 2。
3.3 三組上清液和細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)水平比較 SA刺激細(xì)胞后,細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6表達(dá)和細(xì)胞裂解后TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05);PA預(yù)處理后,能顯著抑制TNF-α和IL-6表達(dá)(P均<0.05),見封四圖3。
3.4 PA對RAW264.7細(xì)胞相關(guān)炎癥信號(hào)通路的影響 SA刺激能引起P38、ERK、JNK和P65蛋白顯著活化,PA預(yù)處理明顯抑制P65蛋白活化,但對P38、ERK和JNK的活化無抑制作用,顯示PA預(yù)處理可以抑制SA誘導(dǎo)的P65炎癥信號(hào)通路激活。見封三圖4。
SA是人類最常見的化膿感染性病原體,當(dāng)SA感染機(jī)體后釋放一系列毒素和侵襲性酶,會(huì)引發(fā)局部性化膿感染,也可引起包括心包炎、肺炎、敗血癥、膿毒癥等致死性疾病[10-13]。臨床數(shù)據(jù)[14-15]顯示,金葡菌肺炎在全球已經(jīng)十分普遍,并且伴隨著較高的死亡率,這對人類的身心健康造成極大的挑戰(zhàn)。SA作為Toll樣受體信號(hào)通路配基能特異性結(jié)合細(xì)胞膜上的TLR2受體,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括誘導(dǎo)TNF-α和IL-6等炎癥因子釋放,進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),并引起中性粒細(xì)胞募集,在急性肺炎中發(fā)揮重要的作用[16]。
本實(shí)驗(yàn)顯示,與對照組小鼠比較,SA可顯著提高肺組織炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)(P<0.05),促進(jìn)小鼠肺部病理學(xué)損傷,顯示SA肺炎模型建立成功。SA感染宿主后,促進(jìn)機(jī)體釋放大量炎癥因子,誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生病理學(xué)改變[17-18]。PA常見于人類食用植物中,能被人體吸收,研究[19]發(fā)現(xiàn),PA具有良好的抗炎生物學(xué)活性。本研究結(jié)果顯示,SA感染小鼠后,小鼠BALF液炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)和小鼠肺勻漿TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05);SA刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7后,細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6表達(dá)和細(xì)胞裂解后的TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05);PA可顯著抑制肺組織和巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)(P均<0.05),減輕小鼠肺部病理學(xué)損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PA可能通過抑制炎癥因子的釋放改善肺組織病理損傷。
MAPK和NF-κB信號(hào)通路是近年來研究極為廣泛的炎癥信號(hào)通路,MAPK家族包括P38 MAPK、ERK MAPK和JNK MAPK三個(gè)亞家族,已有研究[20-21]報(bào)道MAPK在急性炎癥應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用,是參與應(yīng)激過程中調(diào)控多種基因表達(dá)的重要介質(zhì)。NF-κB參與免疫和炎癥反應(yīng)早期過程炎癥因子表達(dá)的調(diào)控,包括激活多種炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等[22]。
由于 TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子主要由細(xì)菌毒素等物質(zhì)作用的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生[3],加上小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長,影響因素較多,而細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)傳導(dǎo)變化較快,故為進(jìn)一步深入研究PA作用的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng),PA提前干預(yù)的方法進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SA刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7后p-ERK、p-JNK、p-P38和p-P65的表達(dá)明顯增加,同時(shí)發(fā)現(xiàn)PA提前干預(yù)之后p-ERK、p-JNK和p-P38的表達(dá)與模型組一致,而P65磷酸化較模型組明顯減輕。提示PA對SA肺炎小鼠的保護(hù)機(jī)制可能與抑制P65蛋白的過度磷酸化有關(guān),因此我們推測PA抑制炎癥而減輕SA肺炎,可能與抑制P65信號(hào)通路激活相關(guān),至于PA是通過何種途徑抑制P65信號(hào)通路激活有待進(jìn)一步探討。