急性呼吸窘迫綜合征大鼠血小板絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化水平

劉 宏，范曉枝，田新強(qiáng)，李 冰

（1.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同037009；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸科，山西太原030001；3.山西省臨汾市中心醫(yī)院呼吸科，山西臨汾041000）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見(jiàn)的急危重癥，占全球重癥監(jiān)護(hù)病房所有患者的10.4%[1]。近年來(lái)支持治療的進(jìn)展使其28 d的死亡率降低到了33%，但有效療法的確定仍然難以捉摸[2]。雖然人們已經(jīng)進(jìn)行了幾十年的研究，但對(duì)ARDS的發(fā)病機(jī)理仍然不是很清楚。本課題組既往對(duì)ARDS進(jìn)行了一些研究，注意到此時(shí)血液中有高凝狀態(tài)，抑制血小板聚集的一些藥物對(duì)ARDS有一定的治療作用[3-4]。本文介紹的內(nèi)容，是在既往研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)ARDS發(fā)病時(shí)血小板激活的信號(hào)通路進(jìn)行的一次研究。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立和取樣

本次實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠，體重250～400 g，共30只。將其分成5組，其中實(shí)驗(yàn)組4組（油酸2 h組，油酸6 h組，油酸24 h組，油酸72 h組），對(duì)照組1組。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)尾靜脈注射油酸d的辦法（0.25mL/kg）制作ARDS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)照組則注射等劑量生理鹽水。分別在注油酸后的2、6、24、72 h，注鹽水后的2 h，采血進(jìn)行血小板分離，將動(dòng)物處死做相關(guān)病理檢查。

1.2 肺系數(shù)計(jì)算和肺病理學(xué)檢查

在各時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，開(kāi)胸取肺，對(duì)肺的大小、表面狀況、彈性等進(jìn)行觀察。之后，稱肺濕重并算出肺系數(shù)（肺濕重/體重×100）。然后，分離左右肺，將左肺用福爾馬林溶液（10%）浸泡一周后按常規(guī)方法做病理切片，HE染色，光鏡下觀察；右肺稱濕重，再置80℃烤箱中烘干，計(jì)算肺濕重/干重比值（R w/d）。

1.3 血小板絲裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）磷酸化水平測(cè)定

在各時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物時(shí)，在腹主動(dòng)脈上段采血10 mL，分離血小板后提取血小板蛋白,再用免疫印跡法測(cè)定血小板中p38 MAPK的磷酸化水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物狀態(tài)

動(dòng)物在注油酸2～3 min后出現(xiàn)明顯的呼吸困難，進(jìn)食進(jìn)飲減少，活動(dòng)減少，呈癱軟無(wú)力狀和爬行步態(tài)。24 h后上述表現(xiàn)好轉(zhuǎn)，72 h后大致恢復(fù)原狀。對(duì)照組未見(jiàn)異常表現(xiàn)。

2.2 肺系數(shù)和Rw/d

各組大鼠肺系數(shù)和R w/d變化見(jiàn)附表1。表中顯示，油酸2～24 h組肺系數(shù)及Rw/d均有增加，以2 h組最明顯。對(duì)照組未見(jiàn)異常改變。

表1 對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肺系數(shù)及Rw/d比值(±s)

表1 對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肺系數(shù)及Rw/d比值(±s)

注:*與對(duì)照組比較，P＜0.05。

分組(n)對(duì)照組油酸2h組油酸6h組油酸24組油酸72組肺濕/干重比(n=6)3.3±0.36.0±0.6*5.6±0.2*5.3±1.4*4.8±0.7*肺濕重(n=6)2.2±0.74.8±1.1*4.1±0.8*3.6±0.3*2.4±0.3*體重(n=6)354.2±60.2368.5±46.0372.8±39.6406.7±40.0252.5±5.2肺系數(shù)(n=6)0.6±0.11.3±0.2*1.1±0.1*0.9±0.1*0.9±0.1*

2.3 肺病理學(xué)變化

2.3.1 肉眼觀察

對(duì)照組肺臟大小正常，柔軟，表面光滑，粉紅色，小葉紋理清晰。油酸組動(dòng)物，雙肺腫脹，重量增加。其中2 h、6 h、24 h組，肺臟腫脹明顯，外觀呈紫紅色、花斑狀；72 h組，肺臟腫脹有所減輕，彈性差，表面不平，呈灰白色。

2.3.2 光鏡觀察

對(duì)照組動(dòng)物肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物，肺泡間隔無(wú)增厚。油酸組，2 h、6 h、24 h組有程度不同的肺泡水腫和肺間質(zhì)水腫，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞滲出和染色深紅、均勻一致的透明膜形成，有肺泡出血和肺間質(zhì)出血，肺間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)和小血管擴(kuò)張及充血；72 h組動(dòng)物，肺泡腔炎細(xì)胞和液體滲出物大部吸收，肺泡腔狹窄，肺泡隔增厚，肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，有纖維組織增生和微血栓形成。

2.4 血小板p38 MAPK磷酸化水平

如圖1所示，2～72 h油酸組動(dòng)物，血小板p38 MAPK磷酸化水平均高于對(duì)照組，以2 h最高，其后逐步下降；除24 h與72 h組外，其余各組兩兩比較均有差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

ARDS的輕癥或早期階段曾被稱作急性肺損傷（acute lung injury，ALI），其病死率高，在美國(guó)接近50%[5]。近年引起一定程度恐慌的病毒感染性疾病如嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、H5N1型禽流感和H1N1甲型流感，均可引起ARDS[6]。盡管對(duì)ARDS的有效治療方法有限，但如能及時(shí)識(shí)別ARDS并使用肺保護(hù)性機(jī)械通氣策略治療，可降低死亡率。然而，ARDS的臨床診斷經(jīng)常被延誤或錯(cuò)過(guò)，導(dǎo)致治療遲緩，治療不足或治療不適當(dāng)[7]。

圖1 各組動(dòng)物血小板p38 MAPK磷酸化水平

血小板是哺乳動(dòng)物特有的、無(wú)核的、多功能血細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，主要作用是參與止血。盡管傳統(tǒng)上認(rèn)為血小板在止血中起著核心作用，許多研究清楚地表明這些血液成分是有效的免疫調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)物。已顯示血小板直接識(shí)別、隔離和殺滅病原體，激活并將白細(xì)胞募集至感染部位和炎癥部位，并調(diào)節(jié)白細(xì)胞行為，增強(qiáng)其吞噬和殺死病原體并誘導(dǎo)獨(dú)特效應(yīng)功能的能力。這種對(duì)感染和炎癥的多方面反應(yīng)，部分歸因于大量可溶性介質(zhì)和由血小板表達(dá)的細(xì)胞表面分子。從他們最早起源于無(wú)脊椎動(dòng)物的原始血細(xì)胞到它們現(xiàn)在的巨核細(xì)胞衍生的細(xì)胞質(zhì)形式，血小板已經(jīng)發(fā)展成為宿主血管內(nèi)免疫和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑之一[8-10]。

血小板和肺有密切的關(guān)系，其持續(xù)循環(huán)通過(guò)肺血管并且在止血和炎癥中具有主要的效應(yīng)物活性。肺是巨核細(xì)胞的儲(chǔ)存器，而巨核細(xì)胞是血小板生成中必需的前體細(xì)胞，因此肺是血小板的貯存池和生產(chǎn)場(chǎng)所。肺臟參與產(chǎn)生血小板的復(fù)雜過(guò)程。在受到刺激時(shí)，肺臟可釋放血小板。血小板有助于肺泡毛細(xì)血管的基礎(chǔ)屏障完整性，調(diào)節(jié)肺血管的滲透性，選擇性地限制水、蛋白質(zhì)和紅細(xì)胞從血管中轉(zhuǎn)移出來(lái)。血小板也有助于肺血管修復(fù)。因此，血小板在保持肺的防御功能及其完整性方面十分重要。但是，盡管可以增強(qiáng)健康肺部的止血和炎癥防御，血小板也是多種肺部疾病和綜合征的損傷效應(yīng)物[11]。Zhao J等人的實(shí)驗(yàn)表明，與輸注新鮮血小板相比，給小鼠輸注儲(chǔ)存的血小板會(huì)引起更嚴(yán)重的肝臟和肺組織損傷[12]。在疾病的早期階段檢測(cè)肺癌，對(duì)于提高患者的生存率可能至關(guān)重要。有必要用新型敏感性和特異性生物標(biāo)志物以及可以替代使用的早期檢測(cè)，補(bǔ)充當(dāng)前的常規(guī)診斷程序。最近，液體活組織檢查證實(shí)了其在晚期非小細(xì)胞肺癌中的臨床用途。來(lái)自液體活組織檢查的不同生物資源，包括受腫瘤教育的血小板（tumor-educated platelets，TEP）也因其在肺癌診斷中的潛在作用而被廣泛研究[13]。實(shí)驗(yàn)研究和臨床證據(jù)表明，在ARDS肺泡損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，活化的血小板起重要作用。它可促進(jìn)肺泡毛細(xì)血管膜的損傷，增加血管的滲透性，促進(jìn)肺水腫的形成。血小板數(shù)量和功能的改變，會(huì)影響ARDS的自然病史[6,11]。

血小板在ARDS肺病理變化中的作用已經(jīng)引起了人們的關(guān)注，但其時(shí)血小板活化的機(jī)制及信號(hào)通路還不清楚。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）與肺部疾病有密切的關(guān)系。MAPK是細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括c-Jun N末端蛋白激酶（JNKs）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)的蛋白激酶（ERKs）和p38激酶（p38 MAPK）3個(gè)亞家族。大多數(shù)細(xì)胞中存在MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該途徑在將細(xì)胞外的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞及其細(xì)胞核并引起細(xì)胞生物反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在高等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中有多個(gè)平行的MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑，不同的細(xì)胞外刺激可以用不同的MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通過(guò)這些信號(hào)通路的相互調(diào)節(jié)，來(lái)介導(dǎo)不同的細(xì)胞生物反應(yīng)。Vallese D等人[14]研究了穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病（COPD）病人、輕度哮喘患者和對(duì)照受試者支氣管活檢組織中磷酸化p38 MAPK（p-p38MAPK）的免疫組織化學(xué)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期COPD病人與對(duì)照受試者的pp38MAPK表達(dá)相似；與穩(wěn)定期COPD病人和對(duì)照受試者相比，哮喘患者的p-p38MAPK表達(dá)增加。Vallese D等還在體外實(shí)驗(yàn)中用過(guò)氧化氫（H2O2）和脂多糖（LPS）處理了支氣管上皮，發(fā)現(xiàn)其中的p38 MAPK mRNA顯著增加，表明p38 MAPK可能在COPD惡化期間有潛在作用。國(guó)內(nèi)劉力興等[15]用PCR熒光檢測(cè)法測(cè)定COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中p38 MAPK的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核內(nèi)p38 MAPK表達(dá)量高于對(duì)照組，提示p38 MAPK參與了COPD的炎癥反應(yīng)。朱保月等[16]發(fā)現(xiàn)，重癥胰腺炎急性肺損傷大鼠肺組織磷酸化p38蛋白表達(dá)明顯增高，p38抑制劑SB203580通過(guò)減輕肺組織中磷酸化p38的表達(dá)，從而減輕肺組織的損傷。

研究表明，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也是重要的血小板激活途徑，該途徑的激活可介導(dǎo)血小板釋放、變形、黏附和聚集。但是，關(guān)于該途徑在ARDS時(shí)血小板活化中作用的研究，目前很少見(jiàn)報(bào)道。本課題組在稍早些的研究中發(fā)現(xiàn)，血小板內(nèi)MAPKs信號(hào)系統(tǒng)JNKs亞家族中的JNK蛋白激酶磷酸化水平明顯增高[17]，ERKs亞家族中的MEK1蛋白激酶磷磷酸化水平明顯增高[18]，p38激酶亞家族中的MKK3蛋白激酶磷酸化水平明顯增高[19]。其中，MKK3是p38激酶的上游蛋白激酶，可特異性地激活p38激酶[20]。本次研究結(jié)果顯示，2～72h油酸組動(dòng)物，血小板p38 MAPK磷酸化水平均高于正常對(duì)照組，在2 h處達(dá)峰值，其后逐步下降，其變化規(guī)律與肺系數(shù)、肺濕/干重比值、肺組織病理變化規(guī)律大體一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ARDS時(shí)血小板的活化過(guò)程有MAPKs信號(hào)途徑的啟動(dòng)，即MAPKs信號(hào)途徑參與了ARDS血小板活化的過(guò)程。

血小板的活化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其涉及的是復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，而不是簡(jiǎn)單的信號(hào)通路。血小板內(nèi)有復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)可以對(duì)多種血小板激活劑如ADP、凝血酶、TXA2、膠原蛋白和腎上腺素等做出反應(yīng)，這是血小板活化的基礎(chǔ)[21]。對(duì)血小板信號(hào)傳導(dǎo)途徑的了解有助于已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)踐或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗血小板藥物的開(kāi)發(fā)，從而有利于將來(lái)ARDS的臨床治療。本次研究是對(duì)ARDS時(shí)血小板活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的部分探索，今后還有許多工作要做。