壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松大鼠血清BGP、TRAP、SOD含量的影響

張小莉 楊軍

摘要：目的 探討壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松大鼠血清骨鈣素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）以及血清超氧化物歧化酶（SOD）表達的影響。 方法 將實驗動物分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組、壯骨止痛方低劑量治療組、雌二醇組5組，用酶聯(lián)免疫免法測定大鼠血清中BGP、TRAP 、SOD的水平。結(jié)果 模型組大鼠血清OPg，SOD降低、TRAP水平升高，經(jīng)壯骨止痛方藥物干預(yù)后，大鼠血清OPg，SOD水平明顯下降、TRAP水平明顯下降。結(jié)論 壯骨止痛方藥物可以提升大鼠血清OPg，SOD的比值，降低TRAP的水平，達到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用。

關(guān)鍵詞：壯骨止痛方;骨鈣素;抗酒石酸酸性磷酸酶;超氧化物歧化酶

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）09-0071-03

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是以骨量減少，骨小梁變細、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄等骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的一種全身性骨病[1]。隨著人口老齡化的迅速到來，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴重的社會問題，其發(fā)病率已經(jīng)躍居世界各種常見病的第7位[2]。壯骨止痛方是湖南省名中醫(yī)莫新民教授研發(fā)而成，已經(jīng)獲得國家新藥證書（國藥證字Z20050125），對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好療效[3-6]。本研究以經(jīng)典的骨質(zhì)疏松動物模型，用壯骨止痛方藥物進行干預(yù)治療，檢測大鼠血清中BGP，TRAP，SOD 含量變化，從而揭示壯骨止痛方預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用機制。

1 材料

1.1 實驗藥物 壯骨止痛方（補骨脂、淫羊藿、枸杞、黨參、白術(shù)、芍藥、骨碎補、丹參、甘草）藥物由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，動物灌胃前制備成混懸液，戊酸雌二醇（生產(chǎn)企業(yè)：拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，藥品批準文號：國藥準字J20130009）

1.2 實驗動物 SD大鼠50只，SPF級，體重（ 200 ±20）g，雌鼠，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2012-0007。動物飼養(yǎng)于清潔級飼養(yǎng)室，期間自由飲水、攝食，室溫20-25℃，濕度40%-70%，光照周期12h/12h，通風(fēng)良好。

1.3 試劑與儀器 青霉素（華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020655）;大鼠骨鈣素（BGP）ELISA檢測試劑盒，大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）ELISA檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA檢測試劑盒均購自（E20160801A，蘇州爾卡文生物科技有限公司）。ELX808-IU酶標儀（美國寶特）;BT-25S型電子天平（上海），0.5-10 l、2-20 l、1-200 l，200-1000 l移液槍。

2 方法

2.1 動物造模 參照文獻方法復(fù)制雌性大鼠去卵巢3個月的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型[7]，取同批次250 g左右的雌性SD大白鼠共40只，月齡10～12個月。按體重將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組（13.2 g/kg/d）、壯骨止痛方低劑量治療組（3.3 g/kg/d）、雌二醇組（0.167 mg/kg/d）共5組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余4組均切除雙側(cè)卵巢造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型。

2.2 給藥方法 假手術(shù)組和模型組每天灌胃以相應(yīng)體積冷開水，壯骨止痛方治療組、雌二醇組灌胃以相應(yīng)藥物，劑量按成人劑量及人鼠體表面積折算確定。各組均從第5天拆線后開始給藥，每天灌胃一次，連續(xù)12周。

2.2 標本采集 給藥12周，最后一次灌胃后2 h，處死各組大鼠，從腹主動脈取血，分離血清后，再轉(zhuǎn)放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆么治觥?/p>

2.3 指標檢測 指標檢測前，嚴格按試劑盒說明書進行相關(guān)項目的測定。主要測定大鼠血清BGP，TRAP，SOD 含量變化，方法為酶聯(lián)免疫分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS16.0軟件包分析，實驗設(shè)計為多因素非平衡的組合類型，將組別拆分成兩個組合進行比較，即模型組與空白組進行比較，模型組與觀察組、對照組進行比較，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，先進行正態(tài)分析，符合要求后各組間差異分別采用單因素方差分析和t檢驗，P值小于0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

結(jié)果如表1所示：（1）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BGP含量明顯下降（P<0.01），說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功;與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中BGP含量明顯升高（P<0.05），均有統(tǒng)計學(xué)差異。提示壯骨止痛方藥物對升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清BGP含量有較好作用。（2）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中SOD含量明顯下降（P<0.01），有顯著差異;與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組、低劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中SOD含量明顯升高（P<0.05），提示壯骨止痛方藥物對升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清SOD含量有較好作用。（3）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TRAP含量明顯升高（P<0.01），有顯著差異;與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組大鼠血清中TRAP含量明顯下降（P<0.01），提示壯骨止痛方藥物對降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清TRAP含量有較好作用。

表1 各組大鼠血清中BGP、SOD及TRAP含量變化

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)多屬“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”等范疇，如《素問·痿論》“腎者水藏也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，辨證主要是肝腎虧虛，壯骨止痛方由補骨脂、淫羊藿、枸杞、黨參、白術(shù)、芍藥、骨碎補、丹參、甘草九味藥物組成，具有補益肝腎、壯骨止痛之功，防治骨質(zhì)疏松癥，均取得良好療效。

骨鈣素（ Osteocalcin，OCN），也稱γ-羧基谷氨酸蛋白（ Bone γCarboxyglutamic Acid-Containing Protein，BGP）或 骨 依 賴 維 生 素K 蛋 白（ Bone V itamin K Dependent Protein），BGP 主要由骨和牙齒中的成骨細胞合成并分泌，是體內(nèi)最豐富的非膠原骨基質(zhì)蛋白，將其作為羥基磷灰石晶體儲存在骨礦物基質(zhì)中，它被認定為骨形成標志物是反映成骨細胞活性的特異而敏感的標志物[8]，BGP 依種屬的不同由 47-50個氨基酸組成，其共同特點是 17、21、24 位有3個羧化的谷氨酸殘基以及 23、29 位形成一個分子內(nèi)二硫健，在 Ca2+存在條件下，羧化后 BGP16- 25 位氨基酸殘基形成一緊密的α螺旋結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象使 3 個谷氨酸殘基突向同一方向排列，促進其與羥磷灰石結(jié)合[9]。

最新研究表明，骨為新型的內(nèi)分泌器官，具有內(nèi)分泌功能[10]，骨鈣素為其中之一，其主要的作用途徑是：成骨細胞產(chǎn)生的 OCN 以低羧化骨鈣素（undercarboxylated-osteocalcin，ucOCN）的形式釋放入血，通過血液循環(huán)達到多種組織器官調(diào)節(jié)能量代謝[11]，作用于胰島β細胞，促進胰島素的產(chǎn)生和分泌，胰島素正反饋骨，促進骨鈣素的活化，達到預(yù)防骨質(zhì)疏松的目的。

在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BGP含量明顯下降（P<0.01），說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功;經(jīng)過壯骨止痛方藥物干預(yù)后，與模型組比較，尤其是壯骨止痛方高劑量組大鼠血清中BGP含量明顯升高，（P<0.05），統(tǒng)計學(xué)差異明顯。提示壯骨止痛方藥物可以提升絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清BGP含量，增加大鼠成骨細胞的活性，從而達到治療骨質(zhì)疏松的作用。

抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）是酸性磷酸酶6種同工酶中的一種，即第 5 型，主要由破骨細胞釋放，骨吸收時TRAP 參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于骨質(zhì)疏松的治療原則[12]，主要為抑制骨吸收，促進骨形成。因此，血清中的 TRAP可以反映體內(nèi)破骨細胞活性和骨吸收狀態(tài)。TRAP 缺乏和過度表達的大鼠模型分別表現(xiàn)為骨硬化和骨質(zhì)疏松。

在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TRAP含量明顯升高（P<0.01），說明骨質(zhì)疏松癥可以引起TRAP含量下降，經(jīng)過壯骨止痛方藥物干預(yù)后，與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組大鼠血清中TRAP含量明顯下降（P<0.01），提示壯骨止痛方可以降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清TRAP含量，抑制破骨細胞的生成，從而達到治療骨質(zhì)疏松的作用。

氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松發(fā)病機制研究中的熱點，其核心理論是：在衰老或者長期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等刺激物時，機體中活性氧自由基（ROS），ROS在人體處于平衡狀態(tài)下的自由基濃度很低，不但不會對機體造成損傷，而且還具有信號調(diào)節(jié)、代謝、生存和凋亡等重要的生理功能，只有在在代謝過程中大量堆積，遠遠超出機體自身的清除能力，引發(fā)氧化應(yīng)激（OS），并誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生衰老和凋亡，最后導(dǎo)致機體發(fā)生與骨質(zhì)疏松等退行性疾病[13]，機體抗氧化酶防御系統(tǒng)中的SOD，能有效地清除過多的ROS，以保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而保護機體免受氧化損傷[14]。

在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中SOD含量明顯下降（P<0.01）;經(jīng)過壯骨止痛方藥物干預(yù)后，與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組、低劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中SOD含量明顯升高（P<0.05），提示壯骨止痛方藥物可以提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清SOD含量，可能通過體內(nèi)清除引發(fā)氧化應(yīng)激的物質(zhì)，從而達到防治骨質(zhì)疏松的療效。

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（收稿日期：2018-05-15）