一種白蠟樹(shù)真菌病害的分離與鑒定

覃瑩菲，張 鑫，陳 岳，李成剛，譚新球

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

白蠟樹(shù)（Fraxinus chinensisRoxb）為木犀科梣屬大型落葉喬木[1]，在我國(guó)共有27 種。白蠟樹(shù)高15～20 m，樹(shù)皮呈灰褐色，頂生的小葉與側(cè)生的小葉等大或稍大，羽狀復(fù)葉長(zhǎng)15～25 cm，葉柄長(zhǎng)4～6 cm。白蠟樹(shù)耐旱，萌發(fā)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，樹(shù)形優(yōu)美，材理通直，還有較強(qiáng)的耐鹽性，常種植于鹽堿地以改良環(huán)境，具有較好的綠化及生態(tài)價(jià)值[2]。白蠟樹(shù)在我國(guó)種植歷史悠久、分布甚廣，其植株生長(zhǎng)迅速，枝條柔韌可供編制各種用具，樹(shù)皮還具有較高的藥用價(jià)值[3]，相關(guān)產(chǎn)業(yè)具有一定規(guī)模。

近年來(lái)，白蠟樹(shù)病蟲(chóng)害問(wèn)題日益嚴(yán)重，在樹(shù)苗期和成熟期對(duì)白蠟樹(shù)造成嚴(yán)重危害，阻礙白蠟樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。研究報(bào)道，由立枯絲核菌引起的立枯病是白蠟樹(shù)苗期的主要病害，主要危害地下根部和莖基部，導(dǎo)致白蠟樹(shù)出現(xiàn)不規(guī)則褐色凹陷的病斑，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致幼苗死亡[4]。白蠟褐斑病主要危害葉片，病斑為灰褐色，表面分布深褐色霉點(diǎn)，會(huì)造成葉片脫落或變形，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使植株死亡[5]。流膠病也會(huì)影響白蠟樹(shù)的生長(zhǎng)，其發(fā)生與氣候、栽培管理水平、土壤土質(zhì)等有相關(guān)性，真菌侵染或者病蟲(chóng)侵入都會(huì)導(dǎo)致流膠病，具體癥狀為白蠟枝干流出黃色膠狀物質(zhì)，最終導(dǎo)致樹(shù)體衰弱、枯竭[6]。白蠟枯梢病由白蠟鞘孢菌所致，病部出現(xiàn)潰瘍或壞死，且木質(zhì)部褪綠明顯，當(dāng)病斑擴(kuò)展環(huán)繞枝條，就會(huì)產(chǎn)生枯梢[7]。按昆蟲(chóng)類(lèi)別劃分，為害白蠟樹(shù)的常見(jiàn)害蟲(chóng)有蟬蛾目瘦蛾科害蟲(chóng)，鱗翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目等害蟲(chóng)。白蠟樹(shù)從春天長(zhǎng)葉到秋冬落葉，均受害蟲(chóng)侵?jǐn)_[8]。白蠟窄吉丁初孵幼蟲(chóng)會(huì)從白蠟樹(shù)韌皮部啃食至木質(zhì)部，導(dǎo)致樹(shù)皮開(kāi)裂、脫落[9]。白蠟梢距甲成蟲(chóng)啃食樹(shù)苗葉柄，使得葉片萎縮，幼苗不能正常生長(zhǎng)[10]?？傊喾N病蟲(chóng)害導(dǎo)致白蠟樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，外觀受損嚴(yán)重甚至死亡，不利于環(huán)境美化和經(jīng)濟(jì)效益提高。因此，鑒定白蠟樹(shù)病蟲(chóng)害的對(duì)白蠟樹(shù)的生長(zhǎng)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

鏈格孢屬（Alternariaspp.）真菌寄主廣泛，可為害糧食作物、蔬菜、花卉、數(shù)木等多種經(jīng)濟(jì)作物，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，鏈格孢菌（Alternaria alternata）廣泛分布在糧食、飼料、土壤和腐爛有機(jī)物質(zhì)中，部分致病的鏈格孢菌對(duì)其寄主植物具有致病毒素，從而侵染寄主植物[11]。如柑橘鏈格孢褐斑病主要危害橘、柚、橙等，引起落葉落果和枯梢，帶病斑果實(shí)難以銷(xiāo)售[12]。鏈格孢侵染枸杞后，會(huì)產(chǎn)生典型黑霉病癥狀，病斑周?chē)仕疂n狀，中部產(chǎn)生白色菌絲，果實(shí)漸漸軟化、變黑，失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13]。羅光明等[14]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究了梔子接種鏈格孢菌后在基因轉(zhuǎn)錄上的差異，分析了關(guān)鍵通路和關(guān)鍵基因，有助于探明鏈格孢菌與植物的互作機(jī)制。文中探明對(duì)白蠟樹(shù)葉片的致病菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，以期為白蠟樹(shù)病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 供菌種鑒定的白蠟樹(shù)病葉實(shí)體于2022 年7 月28 日采摘于懷化市芷江縣楊家坪鎮(zhèn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯切成小塊，沸水煮30～40 min，取紗布過(guò)濾，冷卻至室溫，加入葡萄糖20 g，加ddH2O 定容至1 L，分裝至200 mL 錐形瓶（配置固體培養(yǎng)基每瓶加入瓊脂3 g），121℃，滅菌20 min，冷卻后放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 T5 Direct PCR Kit 購(gòu)買(mǎi)自Tsingke Biotechnology 生物有限公司。引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由Tsingke Biotechnology 生物有限公司合成，引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離 內(nèi)生菌的分離參考袁珊珊等[15]方法進(jìn)行了細(xì)微的調(diào)整。將采集的病葉在超凈臺(tái)內(nèi)用1% NaClO 浸泡1 min，隨后轉(zhuǎn)入75% 乙醇中浸泡1 min，用手術(shù)刀片輕輕切割病斑，用接種針小心取出中間病葉，最終獲得2 mm×2 mm 含有病菌的病葉，小心接種在PDA 平板培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種一個(gè)菌塊，重復(fù)5 次，放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察菌株生長(zhǎng)情況2 次。該菌株編號(hào)Z3727-10。

1.2.2 菌絲DNA 提取及檢測(cè) 當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至直徑為3 cm 時(shí)，取邊緣菌絲，在超凈臺(tái)切割成1 mm×1 mm菌絲塊接種至PDA 液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長(zhǎng)情況，待菌絲長(zhǎng)至合適大小，用濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基，保留菌絲球，利用CTAB 法進(jìn)行基因組DNA 提取，將提取的DNA 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，? μL 提取的DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用Syngene G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及其序列鑒定 以提取的基因組DNA 為模板，應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系為2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 樣品0.5μL，加ddH2O 定容至25 μL；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，共計(jì)30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min， 4℃保持。PCR 結(jié)束后取10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并將產(chǎn)物送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登錄NCBI 進(jìn)行Blast 比對(duì)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種形態(tài)特征

采集的葉片病斑如圖1 所示，病斑呈黑色，圓形，表面光滑，病斑中心扁平。菌種分離生長(zhǎng)形態(tài)如圖2 所示，分離的菌絲在生長(zhǎng)速度上并無(wú)明顯差異，菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲濃密程度差異不大，菌絲光滑，有光澤，正面呈白色向四周蔓延生長(zhǎng)，背面有前期黃色物質(zhì)析出，后期呈現(xiàn)黑色，菌絲分布茂密，菌落呈半透明狀，無(wú)水滴析出。

圖1 白蠟樹(shù)病葉

圖2 白蠟樹(shù)病葉分離的病菌菌絲形態(tài)

2.2 菌絲DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

利用CTAB 法提取Z3727-10 菌絲總DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，DNA 條帶清晰明亮，無(wú)拖尾現(xiàn)象，檢測(cè)結(jié)果表明DNA 提取效果良好，基因組DNA 完整，可以用作后續(xù)PCR 試驗(yàn)。以DNA 為模板，利用真菌鑒定通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示目的產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期結(jié)果相同。

圖3 ITS-PCR 凝膠電泳檢測(cè)

2.3 序列比對(duì)

對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為585 bp，且為單峰，表明菌種分離純化成功，無(wú)其他雜菌污染，獲得單一菌種。將目的基因序列在NCBI 中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖4）表明，與待鑒定菌種相似性最高的菌株為Alternaria alternata，query cover 為100%，per.ident 為100%，最終確定病原菌為Alternaria alternata（黑斑病菌）。并對(duì)菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖5 所示，從圖5中可以看出，Z3727-10 屬于鏈格孢屬（Alternala）。

圖4 序列比對(duì)結(jié)果

圖5 菌種系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)

3 討 論

鑒定白蠟樹(shù)病害的病源菌有助于采取有效措施防治白蠟樹(shù)病害，對(duì)白蠟樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。將病原菌進(jìn)行分離后培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)，測(cè)定生長(zhǎng)速率難以準(zhǔn)確判定病原菌種類(lèi)，目前多采用ITS等分子鑒定手段對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，國(guó)際核酸庫(kù)信息資源不斷豐富，將ITS序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì)，序列相似性≥99%，即可以鑒定為相同種[16]，通過(guò)對(duì)白蠟樹(shù)病害菌種的形態(tài)觀察及基因庫(kù)比對(duì)，最終確定病原菌為Alternaria alternata（黑斑病菌）。

黑斑病菌對(duì)多種植物如棗樹(shù)、蘋(píng)果梨、金刺梨等均可造成危害。研究報(bào)道，黑斑病入侵棗樹(shù)后，一般在果實(shí)白熟期開(kāi)始顯現(xiàn)癥狀，且病斑多在果實(shí)頂端或果實(shí)臍部，對(duì)果實(shí)口感造成影響，嚴(yán)重時(shí)造成果實(shí)腐爛，減產(chǎn)40%[17]。黑斑病菌經(jīng)果皮入侵，但在果實(shí)采摘時(shí)無(wú)性狀，貯藏時(shí)發(fā)病率可高達(dá)37%[18]。研究表明，80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑可在室內(nèi)有效抑制黑斑病菌[19]。因此，鑒定白蠟樹(shù)病菌，并及時(shí)采取有效防治措施，對(duì)保護(hù)白蠟樹(shù)與減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。