塞來昔布凝膠透皮促滲劑的配方研究

曾明輝，李 旭，熊靜悅，邱建平，譚正懷*

(1.邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院，成都 611530；2.四川省中醫(yī)藥科學院，成都 610041)

塞來昔布為非甾體抗炎藥，通過抑制環(huán)氧化酶-2阻斷花生四烯酸合成前列腺素而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，適用于急慢性骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎和急性疼痛等疾病的治療[1-2]。藥物能否經(jīng)皮給藥，其前提是藥物能滲透皮膚到達作用部位[3-4]。筆者利用2×2析因設計原則，采用改良Franz擴散池，以塞來昔布的累積釋放量和穩(wěn)態(tài)流量等參數(shù)為指標，用離體鼠皮篩選塞來昔布凝膠劑中透皮促滲劑薄荷醇和氮酮的配方，為塞來昔布凝膠劑的研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 2690高效液相色譜系統(tǒng) (美國Waters公司，包括自動進樣器、996二極管陣列檢測器和Empower3色譜工作站)；BP211型電子天平(美國Sartorius公司)；JD-4B型離體器官恒溫裝置(上海繼德教學實驗器械廠)；78-1型磁力攪拌器(杭州儀表廠)；320R型低溫離心機(德國Hettich公司)；Integral5型純水儀(美國Millipore公司)。

1.2試藥 塞來昔布對照品(印度Pharma Links制藥公司，批號CX/0904，質(zhì)量分數(shù)99.76%)；塞來昔布原料藥(薩斯化學技術有限公司，批號BL230166，質(zhì)量分數(shù)98.03%)；甲醇(TEDIA公司，HPLC/Spectro，批號15025012)；卡波姆(AR，湖北興銀河化工有限公司，批號20151102)；氫氧化鈉(成都長聯(lián)化工試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(AR)，氮酮(批號2014061601)，薄荷醇(批號2014063001)，均為成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；脫毛膏(利潔時家化中國有限公司)。

1.3實驗動物 SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量20±2 g，雄性，由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(川實動管質(zhì)7號)。

2 方法與結果

2.1塞來昔布凝膠劑的制備 處方為塞來昔布0.5 g、卡波姆1.0 g、丙二醇15 g、薄荷醇0.5～1 g和氮酮1～2 g，加純化水至100 g，將上述處方按照凝膠劑的制備方法配制[5]。實驗樣品由四川邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院提供。實驗樣品分為樣品1，2，3和4共4組。樣品1和2中氮酮含量為10 g·kg-1，薄荷醇含量分別為5和10 g·kg-1；樣品3和4中氮酮含量為20 g·kg-1，薄荷醇含量分別為5和10 g·kg-1。

2.2工作曲線的制備

2.2.1色譜條件 Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇-水(85∶15)為流動相；檢測波長：254 nm；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃[6-7]。

2.2.2工作曲線的繪制 精密稱取塞來昔布對照品，加適量甲醇溶解，分別配制成含塞來昔布質(zhì)量濃度為2.50，5.00，10.00，20.00，30.00和40.00 μg·mL-1的對照品溶液，分別按照2.2.1項下色譜條件測定塞來昔布峰面積，結果塞來昔布質(zhì)量濃度在2.50～40.00 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)線性關系良好，其回歸方程為y=35 646.2x-40 216.8，r=0.996 9。塞來昔布供試品色譜峰峰形良好，與其他成分之間具有良好的分離度，對塞來昔布的測定無干擾。

2.2.3回收率和精密度測定 按照2.1項下方法配制塞來昔布空白凝膠劑。精密稱取對照品適量，加入空白凝膠劑，混勻；精密稱取凝膠劑適量，用甲醇溶解、定容，配制成3種不同質(zhì)量濃度的塞來昔布對照品凝膠劑樣品溶液；分別按照2.2.2項下方法進樣3次，代入回歸方程，計算得回收率分別為101.2%±0.71%，99.8%±0.83%和98.82%±0.91%。另取3種不同質(zhì)量濃度的塞來昔布對照品凝膠劑樣品溶液，同法測定，結果日內(nèi)RSD值分別為1.26%，1.07%和1.31%；日間RSD值分別為1.67%，1.52%和1.94%。

2.3塞來昔布凝膠劑經(jīng)皮滲透特性實驗

2.3.1實驗用鼠皮的制備 取小鼠，斷頸處死，用脫毛膏脫去腹部被毛，剔除皮下組織，剝?nèi)∑つw；將無破損皮膚浸于質(zhì)量濃度為9 g·L-1的氯化鈉注射液中，置于4 ℃冰箱中保存。實驗前用質(zhì)量濃度為9 g·L-1的氯化鈉注射液反復沖洗直至無渾濁，濾紙吸干備用。實驗用鼠皮保存時間不得超過24 h。

2.3.2經(jīng)皮滲透實驗 采用改良Franz擴散池[8-9]，將實驗用鼠皮置于給藥池與接受池之間，固定，使真皮層面向接受池，角質(zhì)層面向供給室，鼠皮有效擴散面積為5.0 cm2。分別稱取供試樣品0.5 g，加入給藥池中，并均勻涂布于鼠皮上。將含體積分數(shù)為30%甲醇的PBS緩沖液(pH值為6.8)注入接受池中，驅(qū)除氣泡，保證緩沖液與鼠皮完全吻合。在32 ℃恒溫下持續(xù)攪拌(400 r·min-1)，分別于給藥后1.0，3.0，6.0，9.0和12.0 h抽取接受液20 mL，立即補充相同體積的、32 ℃的接受液。用真空冷凍干燥法去除樣品中的溶劑，殘留物用甲醇溶解并定容，將樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，按照2.2.2項下方法，測定樣品中塞來昔布的質(zhì)量濃度。用以下公式計算塞來昔布凝膠劑中塞來昔布的累積滲透量Q、穩(wěn)態(tài)流量J及滲透系數(shù)Kp[10-11]：

(1)

J=V/A×dQ/dt

(2)

Kp=J/A×Co

(3)

其中，A為鼠皮有效滲透面積(5.0 cm2)；V為每次取樣體積(20 mL)；Pn為第n個取樣點的塞來昔布質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；Co為塞來昔布在制劑中的初始質(zhì)量濃度；dQ/dt為塞來昔布滲透達穩(wěn)態(tài)時的斜率。

2.4實驗結果

2.4.1凝膠劑中塞來昔布的累積滲透量測定結果 實驗結果表明，凝膠劑中塞來昔布的累積滲透量，隨著實驗時間的延長而增大，見表1，其中以實驗樣品3的累積滲透量最大，在實驗時間(12 h)內(nèi)的累積滲透量為14.13 μg·cm-2。

2.4.2凝膠劑中塞來昔布透皮滲透參數(shù)的計算 將各實驗樣品組塞來昔布的累積滲透量Q對時間t的平方根進行線性回歸，即得各實驗樣品組的回歸方程，見表2。結果表明，各實驗樣品的塞來昔布的透皮滲透過程均符合Higuchi方程，樣品3的Kp值和J值最大，分別為1.03 μL·cm-4和20.18 mL·cm-2。

表1凝膠劑中塞來昔布的累積滲透量測定結果

樣品不同時間(h)滲透量/μg·cm-213691212.04±0.204.57±0.327.03±0.309.62±0.35 12.24±0.0922.12±0.084.45±0.066.79±0.109.21±0.16 11.76±0.0632.44±0.365.27±1.657.78±1.8910.56±2.32 14.13±3.6542.20±0.284.84±1.367.05±1.719.30±2.35 12.39±3.55

表2凝膠劑中塞來昔布的透皮滲透參數(shù)

樣品方程rJ/mL·cm-2Kp/μL·cm-41Q=4.403t1/2-3.3540.99617.970.922Q=4.159t1/2-3.0090.99116.980.873Q=4.944t1/2-3.7010.99720.181.034Q=4.283t1/2-3.0120.99617.480.89

2.4.3凝膠劑透皮滲透K值的計算 對凝膠中塞來昔布的累積滲透量進行極差分析，分別計算凝膠中塞來昔布在12 h內(nèi)的累積滲透量的K1和K2值，以K值最大的樣品處方為最佳配方。見表3。由表3可知，樣品3中的K1和K2最大，分別為24.63和26.52，即最佳配方為含薄荷醇和氮酮分別為5和20 g·kg-1。

2.4.4凝膠中經(jīng)皮促滲劑交互作用分析結果 對凝膠中塞來昔布在12 h內(nèi)的累積滲透量進行2×2析因設計的方差分析表明，凝膠中氮酮的F值為11.826(P<0.01)，薄荷醇的F值為0.008(P>0.5)。

結果顯示，塞來昔布凝膠中氮酮在促進塞來昔布的經(jīng)皮滲透過程中發(fā)揮主要作用，而薄荷醇則對塞來昔布的經(jīng)皮滲透作用無明顯影響。但在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，薄荷醇與氮酮聯(lián)用時，其F值為2 017.13(P<0.001)，說明兩藥聯(lián)用對凝膠中塞來昔布的經(jīng)皮滲透具有顯著的協(xié)同增效作用，結果見表4。

表3凝膠劑中塞來昔布的累積滲透量極差分析結果

Tab.3 Results of range analysis of cumulative penetration quantity of celecoxib in Celecoxib Gels

樣品氮酮/g·kg-1薄荷醇/g·kg-1累積滲透量/μg·cm-2111.011.76210.512.24320.514.13421.012.39K124.0124.63K226.5225.89R2.511.26

表4凝膠劑中塞來昔布的累積滲透量方差分析結果

Tab.4 Results of variance analysis of cumulative penetration quantity of celecoxib in Celecoxib Gels

方差來源平方和f均方FP校正模型450.104a3150.465645.8420.0005 066.45415 066.45421 186.6540.000薄荷醇0.00210.0020.0080.865氮酮3.07813.07811.8260.005薄荷醇+氮酮 439.7331439.7332 017.1320.000誤差1.90480.275總和5 404.73512校正總和451.62611

注：確定系數(shù)a=0.996(校正確定系數(shù)=0.995)。

3 討論

目前塞來昔布臨床使用的制劑主要為塞來昔布膠囊(商品名西樂葆)，但使用后易發(fā)生胃腸道不良反應，存在導致心血管疾病的風險[12]。

經(jīng)皮給藥要求藥物有一定的透皮速率，大部分藥物的透皮速率都不能滿足治療要求。在提高藥物透皮速率的藥劑學方法中，除改變藥物劑型、改進制劑工藝外，研究最多的方法是在處方中使用適宜的經(jīng)皮促滲劑。目前常用的經(jīng)皮促滲劑主要有氮酮、薄荷醇和二甲亞砜等[13-14]。文獻報道，薄荷醇的用量超過20 g·kg-1時，可導致明顯不良反應[15]。目前對氮酮作為經(jīng)皮滲透劑的相關研究較多，其常用量為10～20 g·kg-1[16-17]。

本實驗采用2×2析因設計原則，設定薄荷醇為5和10 g·kg-1、氮酮為10和20 g·kg-1。實驗結果表明，氮酮對塞來昔布具有促滲作用，但氮酮含量為10和20 g·kg-1時，對塞來昔布的促滲作用無明顯差異；而薄荷醇對塞來昔布則無明顯促滲作用。將薄荷醇與氮酮聯(lián)用時，對塞來昔布的透皮滲透表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，該結果與查振中等[18]報道的薄荷醇和氮酮對吲哚美辛體外促滲透作用的結果相同，薄荷醇和氮酮以一定比例聯(lián)合使用時，對主藥經(jīng)皮滲透可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，其機制目前尚不明確，可能與兩者的促滲作用機制不同相關[14，19]。薄荷醇屬于萜(烯)類化合物，促滲作用可能與其能優(yōu)先地分配進入細胞間隙的角質(zhì)層、增加脂質(zhì)雙分子層的流動性和可逆地裂解細胞間脂質(zhì)等作用有關。氮酮是非離子表面活性劑，其促滲作用與角質(zhì)中類脂質(zhì)產(chǎn)生不規(guī)則排列和溶解皮膚的類脂有關。

實驗結果表明，在實驗設定的范圍內(nèi)，以卡波姆為凝膠基質(zhì)時薄荷醇與氮酮聯(lián)用的最佳配方比例為薄荷醇和氮酮分別為5和20 g·kg-1，以該比例配方組成的塞來昔布凝膠劑，在12 h內(nèi)塞來昔布的累積滲透量的值最大，為14.13 μg·cm-2。筆者前期曾報道[20]，以海藻酸鈉為凝膠基質(zhì)時薄荷醇與氮酮聯(lián)用的最佳配方比例是薄荷醇和氮酮均為10 g·kg-1，以此比例配方組成的塞來昔布凝膠劑，在12 h內(nèi)塞來昔布累積滲透量的最大值為27.39 μg·cm-2。2次實驗證明，對于同一藥物，當選用不同的凝膠基質(zhì)時，在同一時間內(nèi)，藥物的經(jīng)皮滲透量有明顯差異。筆者認為，對塞來昔布而言，選用海藻酸鈉作凝膠劑基質(zhì)明顯優(yōu)于卡波姆。