蒙藥朱日很滴丸抗動脈粥樣硬化作用的研究

郭俊英，韓瑞蘭*，王躍武，曹俊彥，張 謙，邢煜舒

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，呼和浩特 010059)

心血管疾病是嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一，動脈粥樣硬化是心血管疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，可累及冠狀動脈、頸動脈、主動脈和腎動脈等大中動脈血管，并最終引發(fā)冠心病、心絞痛和心律失常等相關(guān)心血管疾病和腦、腎血管疾病[2]，因此，尋找有效治療動脈粥樣硬化疾病的藥物是目前藥學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。蒙醫(yī)藥治療心血管疾病具有有效性、無明顯毒性和不良反應(yīng)的優(yōu)勢[3-4]。蒙藥朱日很滴丸原處方系蒙醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，由廣棗、紅花、梔子、肉豆蔻、草果、檀香、沉香、阿魏、冰片和牛黃10味藥組成。制備方法：按照處方比例稱取廣棗、紅花和梔子，粉碎成粗粉，通過乙醇回流，得醇提物。將上述3種提取物按照處方量折算，與牛黃、冰片混勻，過120目篩，細(xì)粉備用。按照處方比例稱取肉豆蔻、阿魏、沉香、檀香和草果5味藥材，混合粉碎，過10目篩，CO2超臨界萃取，得萃取物。按照處方比例混合醇提物、牛黃、冰片和萃取物，與滴丸基質(zhì)混合，在80 ℃下熔化后，制備滴丸。冷卻劑選擇二甲基硅油。滴丸成型后取出，除去表面二甲基硅油，包衣，即得。朱日很滴丸具有清心火、化瘀血和改善心功能的作用，用于心慌、氣短和胸悶煩躁，臨床上主治冠心病、心絞痛和心律失常等，療效好[5-8]。但其是否具有抗動脈粥樣硬化作用尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過建立兔動脈粥樣硬化模型，考察蒙藥朱日很滴丸抗動脈粥樣硬化的作用，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 BSA224S型電子天平(美國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Leica ASP200S型封閉式全自動組織脫水機(jī)，Leica EG150H型分體式組織包埋機(jī)，Leica RM2135型切片機(jī)，Leica HI1210型攤片機(jī)，Leica AUTO STAINER XL型全自動染色機(jī)(德國徠卡公司)；SAPPHIRE600全自動生化分析儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

1.2試藥 朱日很滴丸(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院)；羧甲基纖維素鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.3動物 普通級日本大耳白兔60只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5±0.3 kg，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物生產(chǎn)中心，動物許可證號：SCXK(蒙)2015-0001。

2 方法

2.1分組及給藥 將60只日本大耳白兔隨機(jī)分為溶媒對照組、模型組、朱日很滴丸高、中、低劑量組和普羅布考組，每組10只，雌雄各半。溶媒對照組，普通飼料喂養(yǎng)，其余各組均給予高脂飼料+牛血清白蛋白(在喂養(yǎng)高脂飼料的基礎(chǔ)上于第1和4周時耳緣靜脈注射牛血清白蛋白，250 mg·kg-1)。第8周造模成功后(第8周，各組兔耳中央動脈采集血液，檢測血脂，與溶媒對照組比較，其余各組血脂顯著升高)，朱日很滴丸高、中和低劑量組在模型組喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，分別灌胃給予朱日很滴丸116，365和1 160 mg·kg-1，普羅布考組在模型組喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，灌胃給予普羅布考 26 mg·kg-1，溶媒對照組和模型組在原有喂養(yǎng)方式的基礎(chǔ)上，灌胃給予等體積羧甲基纖維素鈉，每日1次，連續(xù)4周。各組兔均單籠飼養(yǎng)，足量飲食，自由飲水，共喂養(yǎng)12周。

2.2測定攝食量和動物體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)開始的第1～2周和7～8周測定各組家兔的攝食量和體質(zhì)量值。

2.3血清中各指標(biāo)檢測 分別于實(shí)驗(yàn)0，4，8和12周時，從兔耳中央動脈采集血液4～5 mL，置于不含抗凝劑的普通采血管中，離心，取血清，用全自動生化儀測定CHOL、LDL、TG和HDL水平。并用12周時取得的血清，按照Elisa試劑盒操作步驟，測定各組血清中IL-6、TNF-α、SOD、MDA和ox-LDL的含量。

2.4主動脈油紅O染色測定斑塊覆蓋率 將解剖所得主動脈用蒸餾水沖洗后，置于油紅O染液中浸泡8～10 min，取出，置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中分化后，用蒸餾水沖洗，拍照，用image Pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算斑塊覆蓋率。

2.5主動脈HE染色分析 給藥結(jié)束后，向兔耳緣靜脈注射空氣，形成空氣栓塞，將兔處死。取主動脈，置于體積分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛中固定后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片處理，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 納入日本大耳白兔60只，死亡7只。溶媒對照組：死亡1只，死亡原因不明；模型組：死亡1只，死于腹瀉、厭食；朱日很滴丸低劑量組：死亡1只，將藥物灌入肺部致死；朱日很滴丸中劑量：死亡1只，腦癱致死；朱日很滴丸高劑量組：死亡1只，突發(fā)死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)肺部感染；普羅布考組：死亡2只，1只死于腹瀉厭食，1只死亡原因不明。實(shí)驗(yàn)過程中，總存活率為88%，最終計(jì)入結(jié)果分析的兔數(shù)量為53只。

3.2各組攝食量和體質(zhì)量變化結(jié)果 見表1。

表1兔的平均攝食量和體質(zhì)量增加值

Tab.1 The average intake and the increasing weight of rabbits

組別0～8周平均攝食量/g·只-10～8周體質(zhì)量增加值/kg·只-1溶媒對照組129.08±14.360.73±0.27模型組98.85±10.36**0.88±0.40朱日很滴丸低劑量組105.31±11.01**0.84±0.22朱日很滴丸中劑量組101.14±12.42**0.81±0.36朱日很滴丸高劑量組100.23±8.43**0.83±0.32普羅布考組99.97±9.03**0.87±0.34

注:與溶媒對照組比較**P<0.01。

由表1可知，與溶媒對照組比較，模型組、朱日很滴丸各劑量組和普羅布考組的攝食量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其體質(zhì)量無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3各組血清中TG、LDL、HDL和CHOL含量的測定結(jié)果 見表2。由表2可知，第8周時，與溶媒對照組比較，模型組血脂成分幾乎均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第12周朱日很滴丸組給藥結(jié)束后，與模型組比較，朱日很滴丸各劑量組血清中TG、LDL和CHOL的含量低于模型組，HDL的含量高于模型組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2血清中TG,LDL,HDL和CHOL的含量

Tab.2 The content of TG，LDL,HDL and CHOL in serum

組別TG/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周 LDL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周溶媒對照組0.76±0.150.80±0.240.70±0.170.77±0.160.17±0.090.21±0.070.23±0.070.18±0.09模型組0.88±0.180.94±0.112.46±1.21**3.60±1.21**0.21±0.143.75±4.33*11.41±4.04**21.18±6.49**朱日很滴丸低劑量組0.86±0.131.11±0.21*2.61±1.23** 3.32±0.53#0.18±0.083.45±3.33 9.89±3.03** 20.04±5.31# 朱日很滴丸中劑量組0.77±0.09 1.01±1.05* 2.50±1.66**3.19±2.31#0.15±0.053.05±4.02 10.02±6.83**19.87±10.86#朱日很滴丸高劑量組0.74±0.14 1.21±0.31*2.48±1.21**3.02±0.91#0.14±0.03 3.55±2.1210.09±4.56**18.44±5.33#普羅布考組0.81±0.071.02±0.13*2.54±1.42** 3.21±0.99# 0.16±0.053.25±1.1111.21±3.89**15.24±4.31## 組別HDL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周 CHOL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周溶媒對照組0.22±0.120.26±0.070.22±0.120.22±0.120.81±0.350.94±0.171.02±0.210.81±0.35模型組0.22±0.080.32±0.180.50±0.160.68±0.12*0.88±0.327.59±8.41*20.36±4.68**32.97±3.50**朱日很滴丸低劑量組0.29±0.070.28±0.090.56±0.120.72±0.21#0.86±0.335.89±3.21*15.66±4.52**31.88±3.41#朱日很滴丸中劑量組0.31±0.060.27±0.150.67±0.14*0.87±0.62#0.79±0.215.46±5.41*14.78±2.00**30.89±0.36#朱日很滴丸高劑量組0.24±0.020.29±0.080.54±0.130.90±0.33#0.80±0.215.58±1.32*16.75±3.88**29.87±4.12#普羅布考組0.26±0.040.31±0.030.51±0.180.71±0.28#0.79±0.126.21±2.48**19.32±5.01**25.12±3.21##

注:與溶媒對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P>0.05，##P<0.05。

3.4各組血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量測定結(jié)果 見表3。由表3可知，與溶媒對照組比較，模型組血清中IL-6和TNF-α的含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，朱日很滴丸各劑量組血清中IL-6和TNF-α的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.5各組血清中SOD、MDA和ox-LDL的含量測定結(jié)果 見表4。由表4可知，與溶媒對照組比較，模型組血清中MDA和ox-LDL的含量顯著升高，SOD的含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，朱日很滴丸各劑量組血清中MDA和ox-LDL的含量顯著降低，SOD的含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.6各組主動脈油紅O染色及斑塊覆蓋率測定結(jié)果 見圖1和圖2。由圖1和圖2可知，與溶媒對照組比較，模型組的斑塊覆蓋率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，朱日很滴丸各劑量組主動脈的斑塊覆蓋率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量

Tab.3 The content of IL-6 and TNF-αin serum

組別IL-6/pg·mL-1TNF-α/pg·mL-1溶媒對照組400.25±95.47340.43±78.88模型組1 600.68±300.74**1 900.26±310.83**朱日很滴丸低劑量組1 200.11±147.12##1 483.76±212.13##朱日很滴丸中劑量組900.27±137.33##1 172.76±210.11##朱日很滴丸高劑量組700.24±128.32##863.34±119.56##普羅布考組720.89±127.25##660.87±109.89##

注:與溶媒對照組比較**P<0.01；與模型組比較##P<0.01。

表4血清中SOD、MDA和ox-LDL的含量

Tab.4 The contents of SOD，MDA and ox-LDL in serum

組別SOD/U·mL-1MDA/ng·mL-1ox-LDL/ng·mL-1溶媒對照組176.33±1.8270.15±11.314.27±0.80模型組70.8±18.53**205.53±31.35**6.67±1.91**朱日很滴丸低劑量組94.78±11.21#164.80±41.21#3.64±1.23##朱日很滴丸中劑量組118.8±11.51##144.40±20.98##2.87±0.98##朱日很滴丸高劑量組180.31±18.23##124.21±18.88##2.56±0.56##普羅布考組178.11±19.45##119.23±20.93##2.47±0.75##

注:與溶媒對照組比較**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

圖1主動脈油紅O染色

A.溶媒對照組；B.模型組；C.普羅布考組；D.朱日很滴丸低劑量組；E.朱日很滴丸中劑量組；F.朱日很滴丸高劑量組。

Fig.1 The oil red staining of rabbit aorta

A.control group；B.model group；C.probucol group；D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills；E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills；F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

3.7各組兔主動脈的HE染色結(jié)果 見圖3。由圖3可知，與溶媒對照組比較，模型組平滑肌增生明顯，細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞增多，管壁明顯增厚，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，形成纖維增生性動脈粥樣硬化斑塊。與模型組比較，朱日很滴丸高劑量組細(xì)胞排列較整齊，平滑肌增生不明顯，內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞較少，病變較輕，朱日很滴丸中、低劑量組相應(yīng)病變均有減輕。

圖2兔主動脈斑塊覆蓋率

A.溶媒對照組；B.模型組；C.普羅布考組；D.朱日很滴丸低劑量組；E.朱日很滴丸中劑量組；F.朱日很滴丸高劑量組。

注:與溶媒對照組比較**P<0.01；與模型組比較##P<0.01。

Fig.2 The plaque coverage rate of rabbit aorta

A.control group；B.model group；C.probucol group；D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills；E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills；F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

Note:**P<0.01 compared with vehicle control group；##P<0.01 compared with model group.

圖3各組兔主動脈HE染色結(jié)果(×40)

A.溶媒對照組；B.模型組；C.普羅布考組；D.朱日很滴丸低劑量組；E.朱日很滴丸中劑量組；F.朱日很滴丸高劑量組。

Fig.3 The HE staining result of rabbit aorta(×40)

A.control group；B.model group；C.probucol group；D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills；E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills；F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

4 討論

動脈粥樣硬化主要發(fā)生在大動脈及中動脈，特別是冠狀動脈、腦動脈等部位，并最終引發(fā)冠心病、心絞痛和心律失常等相關(guān)心血管疾病和腦血管疾病[9]。本實(shí)驗(yàn)采用油紅O染色測定兔主動脈斑塊覆蓋率，結(jié)果顯示，朱日很滴丸各劑量組能顯著降低主動脈斑塊覆蓋率；主動脈的HE染色結(jié)果顯示，朱日很滴丸各劑量組能顯著減輕平滑肌增生，與模型組比較，細(xì)胞排列紊亂狀況明顯減輕，內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞明顯減少，管壁增厚狀況、彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清狀況減輕。綜上所述，蒙藥朱日很滴丸能夠發(fā)揮抗兔動脈粥樣硬化的作用。

動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，學(xué)者們曾提出了許多發(fā)病假說，如內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激、感染、慢性炎癥和血脂蛋白學(xué)說等[10]。有些發(fā)病理論如感染假說已被否定，有些學(xué)說如血脂蛋白、氧化、慢性炎癥反應(yīng)和血管平滑肌增殖學(xué)說則逐步得到公認(rèn)[11-12]。從脂蛋白方面講，隨著對脂蛋白研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)主要是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與動脈粥樣硬化的發(fā)生呈正相關(guān)，其機(jī)制是LDL可通過apoB100與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用沉積在動脈內(nèi)膜下形成粥樣斑塊[13]；而高密度脂蛋白中的膽固醇(HDL-C)是將膽固醇逆向運(yùn)輸?shù)礁闻K處理的，可降低血中膽固醇水平，從而抵抗動脈粥樣硬化。從炎癥方面講，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病[14]，以內(nèi)皮損傷為主要特征，可累及單核/巨噬細(xì)胞，多種炎性遞質(zhì)如IL-6和TNF-α等分泌增加[15]。IL-6是重要的趨化因子，能在病灶局部募集多種炎性介質(zhì)，可加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對低密度脂蛋白的攝入，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成；TNF-α是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，能夠直接造成細(xì)胞損傷，也能招募炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移并與內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及泡沫細(xì)胞的形成有關(guān)，同時還能影響斑塊的穩(wěn)定性，深度參與動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[16-17]。從氧化應(yīng)激方面講，近幾年越來越多的證據(jù)表明超氧化物陰離子、羥自由基等活性氧的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)活性之間的失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與動脈粥樣硬化形成有關(guān)[18]。SOD是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶和超氧自由基清除劑，其活性水平的高低代表了組織清除自由基的能力，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其表達(dá)水平高低是機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度的重要標(biāo)志和動脈粥樣硬化的病變指標(biāo)[19]。LDL本身對動脈粥樣硬化的形成并沒有直接作用，過量的LDL會滯留于內(nèi)皮下，經(jīng)過細(xì)胞氧化修飾形成ox-LDL，而ox-LDL會加速泡沫細(xì)胞形成，加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)氧化脂質(zhì)的積累，促進(jìn)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致AS纖維斑塊增大[20]，促進(jìn)血管平滑肌的增生等，是形成動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。

本實(shí)驗(yàn)主要從血脂蛋白、氧化應(yīng)激、炎癥和血管平滑肌增殖等方面綜合考察了蒙藥朱日很滴丸的抗動脈粥樣硬化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在動脈粥樣硬化形成后給予一定時間的朱日很滴丸雖然能使TG、LDL和CHOL的含量小幅降低，HDL的含量小幅升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明朱日很滴丸抗動脈粥樣硬化作用與降血脂作用關(guān)聯(lián)度不大。蒙藥朱日很滴丸能有效降低建模后家兔血清中IL-6、TNF-α、ox-LDL和MDA的含量，提高SOD的活性。結(jié)果表明，蒙藥朱日很滴丸抗動脈粥樣硬化作用與其抗炎、抗氧化應(yīng)激密切相關(guān)，其更深層次及其他方面的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。