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    蒙藥朱日很滴丸抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究

    2018-11-24 02:54:06郭俊英韓瑞蘭王躍武曹俊彥邢煜舒
    西北藥學(xué)雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:劑量血清模型

    郭俊英,韓瑞蘭*,王躍武,曹俊彥,張 謙,邢煜舒

    (1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,呼和浩特 010059;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心,呼和浩特 010059)

    心血管疾病是嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一,動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)[1],可累及冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈等大中動(dòng)脈血管,并最終引發(fā)冠心病、心絞痛和心律失常等相關(guān)心血管疾病和腦、腎血管疾病[2],因此,尋找有效治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物是目前藥學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。蒙醫(yī)藥治療心血管疾病具有有效性、無明顯毒性和不良反應(yīng)的優(yōu)勢[3-4]。蒙藥朱日很滴丸原處方系蒙醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方,由廣棗、紅花、梔子、肉豆蔻、草果、檀香、沉香、阿魏、冰片和牛黃10味藥組成。制備方法:按照處方比例稱取廣棗、紅花和梔子,粉碎成粗粉,通過乙醇回流,得醇提物。將上述3種提取物按照處方量折算,與牛黃、冰片混勻,過120目篩,細(xì)粉備用。按照處方比例稱取肉豆蔻、阿魏、沉香、檀香和草果5味藥材,混合粉碎,過10目篩,CO2超臨界萃取,得萃取物。按照處方比例混合醇提物、牛黃、冰片和萃取物,與滴丸基質(zhì)混合,在80 ℃下熔化后,制備滴丸。冷卻劑選擇二甲基硅油。滴丸成型后取出,除去表面二甲基硅油,包衣,即得。朱日很滴丸具有清心火、化瘀血和改善心功能的作用,用于心慌、氣短和胸悶煩躁,臨床上主治冠心病、心絞痛和心律失常等,療效好[5-8]。但其是否具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立兔動(dòng)脈粥樣硬化模型,考察蒙藥朱日很滴丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,為臨床用藥提供理論依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1儀器 BSA224S型電子天平(美國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);Leica ASP200S型封閉式全自動(dòng)組織脫水機(jī),Leica EG150H型分體式組織包埋機(jī),Leica RM2135型切片機(jī),Leica HI1210型攤片機(jī),Leica AUTO STAINER XL型全自動(dòng)染色機(jī)(德國徠卡公司);SAPPHIRE600全自動(dòng)生化分析儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

    1.2試藥 朱日很滴丸(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院);羧甲基纖維素鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

    1.3動(dòng)物 普通級(jí)日本大耳白兔60只,雌雄各半,體質(zhì)量2.5±0.3 kg,購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蒙)2015-0001。

    2 方法

    2.1分組及給藥 將60只日本大耳白兔隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組、模型組、朱日很滴丸高、中、低劑量組和普羅布考組,每組10只,雌雄各半。溶媒對(duì)照組,普通飼料喂養(yǎng),其余各組均給予高脂飼料+牛血清白蛋白(在喂養(yǎng)高脂飼料的基礎(chǔ)上于第1和4周時(shí)耳緣靜脈注射牛血清白蛋白,250 mg·kg-1)。第8周造模成功后(第8周,各組兔耳中央動(dòng)脈采集血液,檢測血脂,與溶媒對(duì)照組比較,其余各組血脂顯著升高),朱日很滴丸高、中和低劑量組在模型組喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,分別灌胃給予朱日很滴丸116,365和1 160 mg·kg-1,普羅布考組在模型組喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,灌胃給予普羅布考 26 mg·kg-1,溶媒對(duì)照組和模型組在原有喂養(yǎng)方式的基礎(chǔ)上,灌胃給予等體積羧甲基纖維素鈉,每日1次,連續(xù)4周。各組兔均單籠飼養(yǎng),足量飲食,自由飲水,共喂養(yǎng)12周。

    2.2測定攝食量和動(dòng)物體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)開始的第1~2周和7~8周測定各組家兔的攝食量和體質(zhì)量值。

    2.3血清中各指標(biāo)檢測 分別于實(shí)驗(yàn)0,4,8和12周時(shí),從兔耳中央動(dòng)脈采集血液4~5 mL,置于不含抗凝劑的普通采血管中,離心,取血清,用全自動(dòng)生化儀測定CHOL、LDL、TG和HDL水平。并用12周時(shí)取得的血清,按照Elisa試劑盒操作步驟,測定各組血清中IL-6、TNF-α、SOD、MDA和ox-LDL的含量。

    2.4主動(dòng)脈油紅O染色測定斑塊覆蓋率 將解剖所得主動(dòng)脈用蒸餾水沖洗后,置于油紅O染液中浸泡8~10 min,取出,置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中分化后,用蒸餾水沖洗,拍照,用image Pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析,計(jì)算斑塊覆蓋率。

    2.5主動(dòng)脈HE染色分析 給藥結(jié)束后,向兔耳緣靜脈注射空氣,形成空氣栓塞,將兔處死。取主動(dòng)脈,置于體積分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛中固定后,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片處理,進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。

    3 結(jié)果

    3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 納入日本大耳白兔60只,死亡7只。溶媒對(duì)照組:死亡1只,死亡原因不明;模型組:死亡1只,死于腹瀉、厭食;朱日很滴丸低劑量組:死亡1只,將藥物灌入肺部致死;朱日很滴丸中劑量:死亡1只,腦癱致死;朱日很滴丸高劑量組:死亡1只,突發(fā)死亡,尸檢發(fā)現(xiàn)肺部感染;普羅布考組:死亡2只,1只死于腹瀉厭食,1只死亡原因不明。實(shí)驗(yàn)過程中,總存活率為88%,最終計(jì)入結(jié)果分析的兔數(shù)量為53只。

    3.2各組攝食量和體質(zhì)量變化結(jié)果 見表1。

    表1兔的平均攝食量和體質(zhì)量增加值

    Tab.1 The average intake and the increasing weight of rabbits

    組別0~8周平均攝食量/g·只-10~8周體質(zhì)量增加值/kg·只-1溶媒對(duì)照組129.08±14.360.73±0.27模型組98.85±10.36**0.88±0.40朱日很滴丸低劑量組105.31±11.01**0.84±0.22朱日很滴丸中劑量組101.14±12.42**0.81±0.36朱日很滴丸高劑量組100.23±8.43**0.83±0.32普羅布考組99.97±9.03**0.87±0.34

    注:與溶媒對(duì)照組比較**P<0.01。

    由表1可知,與溶媒對(duì)照組比較,模型組、朱日很滴丸各劑量組和普羅布考組的攝食量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但其體質(zhì)量無明顯變化,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3.3各組血清中TG、LDL、HDL和CHOL含量的測定結(jié)果 見表2。由表2可知,第8周時(shí),與溶媒對(duì)照組比較,模型組血脂成分幾乎均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第12周朱日很滴丸組給藥結(jié)束后,與模型組比較,朱日很滴丸各劑量組血清中TG、LDL和CHOL的含量低于模型組,HDL的含量高于模型組,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表2血清中TG,LDL,HDL和CHOL的含量

    Tab.2 The content of TG,LDL,HDL and CHOL in serum

    組別TG/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周 LDL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周溶媒對(duì)照組0.76±0.150.80±0.240.70±0.170.77±0.160.17±0.090.21±0.070.23±0.070.18±0.09模型組0.88±0.180.94±0.112.46±1.21**3.60±1.21**0.21±0.143.75±4.33*11.41±4.04**21.18±6.49**朱日很滴丸低劑量組0.86±0.131.11±0.21*2.61±1.23** 3.32±0.53#0.18±0.083.45±3.33 9.89±3.03** 20.04±5.31# 朱日很滴丸中劑量組0.77±0.09 1.01±1.05* 2.50±1.66**3.19±2.31#0.15±0.053.05±4.02 10.02±6.83**19.87±10.86#朱日很滴丸高劑量組0.74±0.14 1.21±0.31*2.48±1.21**3.02±0.91#0.14±0.03 3.55±2.1210.09±4.56**18.44±5.33#普羅布考組0.81±0.071.02±0.13*2.54±1.42** 3.21±0.99# 0.16±0.053.25±1.1111.21±3.89**15.24±4.31## 組別HDL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周 CHOL/mmol·L-1 0周 4周 8周 12周溶媒對(duì)照組0.22±0.120.26±0.070.22±0.120.22±0.120.81±0.350.94±0.171.02±0.210.81±0.35模型組0.22±0.080.32±0.180.50±0.160.68±0.12*0.88±0.327.59±8.41*20.36±4.68**32.97±3.50**朱日很滴丸低劑量組0.29±0.070.28±0.090.56±0.120.72±0.21#0.86±0.335.89±3.21*15.66±4.52**31.88±3.41#朱日很滴丸中劑量組0.31±0.060.27±0.150.67±0.14*0.87±0.62#0.79±0.215.46±5.41*14.78±2.00**30.89±0.36#朱日很滴丸高劑量組0.24±0.020.29±0.080.54±0.130.90±0.33#0.80±0.215.58±1.32*16.75±3.88**29.87±4.12#普羅布考組0.26±0.040.31±0.030.51±0.180.71±0.28#0.79±0.126.21±2.48**19.32±5.01**25.12±3.21##

    注:與溶媒對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較#P>0.05,##P<0.05。

    3.4各組血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量測定結(jié)果 見表3。由表3可知,與溶媒對(duì)照組比較,模型組血清中IL-6和TNF-α的含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,朱日很滴丸各劑量組血清中IL-6和TNF-α的含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    3.5各組血清中SOD、MDA和ox-LDL的含量測定結(jié)果 見表4。由表4可知,與溶媒對(duì)照組比較,模型組血清中MDA和ox-LDL的含量顯著升高,SOD的含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,朱日很滴丸各劑量組血清中MDA和ox-LDL的含量顯著降低,SOD的含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    3.6各組主動(dòng)脈油紅O染色及斑塊覆蓋率測定結(jié)果 見圖1和圖2。由圖1和圖2可知,與溶媒對(duì)照組比較,模型組的斑塊覆蓋率顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,朱日很滴丸各劑量組主動(dòng)脈的斑塊覆蓋率均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    表3血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量

    Tab.3 The content of IL-6 and TNF-αin serum

    組別IL-6/pg·mL-1TNF-α/pg·mL-1溶媒對(duì)照組400.25±95.47340.43±78.88模型組1 600.68±300.74**1 900.26±310.83**朱日很滴丸低劑量組1 200.11±147.12##1 483.76±212.13##朱日很滴丸中劑量組900.27±137.33##1 172.76±210.11##朱日很滴丸高劑量組700.24±128.32##863.34±119.56##普羅布考組720.89±127.25##660.87±109.89##

    注:與溶媒對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01。

    表4血清中SOD、MDA和ox-LDL的含量

    Tab.4 The contents of SOD,MDA and ox-LDL in serum

    組別SOD/U·mL-1MDA/ng·mL-1ox-LDL/ng·mL-1溶媒對(duì)照組176.33±1.8270.15±11.314.27±0.80模型組70.8±18.53**205.53±31.35**6.67±1.91**朱日很滴丸低劑量組94.78±11.21#164.80±41.21#3.64±1.23##朱日很滴丸中劑量組118.8±11.51##144.40±20.98##2.87±0.98##朱日很滴丸高劑量組180.31±18.23##124.21±18.88##2.56±0.56##普羅布考組178.11±19.45##119.23±20.93##2.47±0.75##

    注:與溶媒對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組比較#P<0.05,##P<0.01。

    圖1主動(dòng)脈油紅O染色

    A.溶媒對(duì)照組;B.模型組;C.普羅布考組;D.朱日很滴丸低劑量組;E.朱日很滴丸中劑量組;F.朱日很滴丸高劑量組。

    Fig.1 The oil red staining of rabbit aorta

    A.control group;B.model group;C.probucol group;D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills;E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills;F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

    3.7各組兔主動(dòng)脈的HE染色結(jié)果 見圖3。由圖3可知,與溶媒對(duì)照組比較,模型組平滑肌增生明顯,細(xì)胞排列紊亂,內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞增多,管壁明顯增厚,彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清,形成纖維增生性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。與模型組比較,朱日很滴丸高劑量組細(xì)胞排列較整齊,平滑肌增生不明顯,內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞較少,病變較輕,朱日很滴丸中、低劑量組相應(yīng)病變均有減輕。

    圖2兔主動(dòng)脈斑塊覆蓋率

    A.溶媒對(duì)照組;B.模型組;C.普羅布考組;D.朱日很滴丸低劑量組;E.朱日很滴丸中劑量組;F.朱日很滴丸高劑量組。

    注:與溶媒對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01。

    Fig.2 The plaque coverage rate of rabbit aorta

    A.control group;B.model group;C.probucol group;D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills;E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills;F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

    Note:**P<0.01 compared with vehicle control group;##P<0.01 compared with model group.

    圖3各組兔主動(dòng)脈HE染色結(jié)果(×40)

    A.溶媒對(duì)照組;B.模型組;C.普羅布考組;D.朱日很滴丸低劑量組;E.朱日很滴丸中劑量組;F.朱日很滴丸高劑量組。

    Fig.3 The HE staining result of rabbit aorta(×40)

    A.control group;B.model group;C.probucol group;D.low dose group of Zhurihen Dropping Pills;E.middle dose group of Zhurihen Dropping Pills;F.high dose group of Zhurihen Dropping Pills.

    4 討論

    動(dòng)脈粥樣硬化主要發(fā)生在大動(dòng)脈及中動(dòng)脈,特別是冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈等部位,并最終引發(fā)冠心病、心絞痛和心律失常等相關(guān)心血管疾病和腦血管疾病[9]。本實(shí)驗(yàn)采用油紅O染色測定兔主動(dòng)脈斑塊覆蓋率,結(jié)果顯示,朱日很滴丸各劑量組能顯著降低主動(dòng)脈斑塊覆蓋率;主動(dòng)脈的HE染色結(jié)果顯示,朱日很滴丸各劑量組能顯著減輕平滑肌增生,與模型組比較,細(xì)胞排列紊亂狀況明顯減輕,內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞明顯減少,管壁增厚狀況、彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清狀況減輕。綜上所述,蒙藥朱日很滴丸能夠發(fā)揮抗兔動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

    動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,學(xué)者們?cè)岢隽嗽S多發(fā)病假說,如內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激、感染、慢性炎癥和血脂蛋白學(xué)說等[10]。有些發(fā)病理論如感染假說已被否定,有些學(xué)說如血脂蛋白、氧化、慢性炎癥反應(yīng)和血管平滑肌增殖學(xué)說則逐步得到公認(rèn)[11-12]。從脂蛋白方面講,隨著對(duì)脂蛋白研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)主要是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生呈正相關(guān),其機(jī)制是LDL可通過apoB100與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜下形成粥樣斑塊[13];而高密度脂蛋白中的膽固醇(HDL-C)是將膽固醇逆向運(yùn)輸?shù)礁闻K處理的,可降低血中膽固醇水平,從而抵抗動(dòng)脈粥樣硬化。從炎癥方面講,動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病[14],以內(nèi)皮損傷為主要特征,可累及單核/巨噬細(xì)胞,多種炎性遞質(zhì)如IL-6和TNF-α等分泌增加[15]。IL-6是重要的趨化因子,能在病灶局部募集多種炎性介質(zhì),可加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白的攝入,促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成;TNF-α是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì),能夠直接造成細(xì)胞損傷,也能招募炎性細(xì)胞,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的損傷,誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移并與內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及泡沫細(xì)胞的形成有關(guān),同時(shí)還能影響斑塊的穩(wěn)定性,深度參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[16-17]。從氧化應(yīng)激方面講,近幾年越來越多的證據(jù)表明超氧化物陰離子、羥自由基等活性氧的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)活性之間的失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)[18]。SOD是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶和超氧自由基清除劑,其活性水平的高低代表了組織清除自由基的能力,MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,其表達(dá)水平高低是機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度的重要標(biāo)志和動(dòng)脈粥樣硬化的病變指標(biāo)[19]。LDL本身對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成并沒有直接作用,過量的LDL會(huì)滯留于內(nèi)皮下,經(jīng)過細(xì)胞氧化修飾形成ox-LDL,而ox-LDL會(huì)加速泡沫細(xì)胞形成,加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)氧化脂質(zhì)的積累,促進(jìn)炎性反應(yīng),導(dǎo)致AS纖維斑塊增大[20],促進(jìn)血管平滑肌的增生等,是形成動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。

    本實(shí)驗(yàn)主要從血脂蛋白、氧化應(yīng)激、炎癥和血管平滑肌增殖等方面綜合考察了蒙藥朱日很滴丸的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在動(dòng)脈粥樣硬化形成后給予一定時(shí)間的朱日很滴丸雖然能使TG、LDL和CHOL的含量小幅降低,HDL的含量小幅升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明朱日很滴丸抗動(dòng)脈粥樣硬化作用與降血脂作用關(guān)聯(lián)度不大。蒙藥朱日很滴丸能有效降低建模后家兔血清中IL-6、TNF-α、ox-LDL和MDA的含量,提高SOD的活性。結(jié)果表明,蒙藥朱日很滴丸抗動(dòng)脈粥樣硬化作用與其抗炎、抗氧化應(yīng)激密切相關(guān),其更深層次及其他方面的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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