HPLC法測(cè)定十香止痛丸中5種成分的含量

朱遠(yuǎn)鋒，孫全明，譚艷萍

(安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安康 725000)

十香止痛丸為傳統(tǒng)治療胃病的中藥制劑，收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，由香附(醋炙)、烏藥、檀香、延胡索(醋炙)、香櫞、蒲黃、沉香、厚樸(姜汁炙)、零陵香、降香、丁香、五靈脂(醋炙)、木香、香排草、砂仁、乳香(醋炙)、高良姜和熟大黃組成，具有疏氣解郁、散寒止痛之功效。用于氣滯胃寒、兩脅脹滿、胃脘刺痛和腹部隱痛[1]。該制劑處方中丁香、厚樸和木香含有丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯成分。目前該制劑標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)目，難以有效控制制劑的質(zhì)量。文獻(xiàn)報(bào)道多采用薄層掃描法[2]和HPLC法[3]測(cè)定十香止痛丸中厚樸酚與和厚樸酚的含量，很少有報(bào)道采用HPLC法同時(shí)測(cè)定十香止痛丸中丁香酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、厚樸酚與和厚樸酚的含量。筆者參考文獻(xiàn)方法[4-18]，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定十香止痛丸中5種成分含量的方法，該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為該制劑的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀，LC-2010AHT紫外檢測(cè)器，LC Solution Single色譜工作站，AUW220D電子分析天平(日本島津公司)；TG332A分析天平(湘儀天平儀器廠)；KQ-250D型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 丁香酚對(duì)照品(批號(hào)110725-201615)、厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110729-201513)、和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110730-201614)、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)111524-201509)和去氫木香烴內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)111525-201504)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；十香止痛丸(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150501，150702，151101)；甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Sigma公司)；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水(8∶50∶42)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。見(jiàn)圖1。

2.2溶液的制備 混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成含丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為65.62，33.85，19.64，25.27和27.49 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取十香止痛丸10丸，剪碎，混勻，取6 g，精密稱(chēng)定，加硅藻土適量，研勻，置于具塞三角瓶中，加乙醚100 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過(guò)，用乙醚20 mL分次洗滌藥渣及濾器，洗液并入濾液，溫水蒸干，殘?jiān)眉状?0 mL分次溶解并移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照(去木香)；D.陰性對(duì)照(去厚樸)；E.陰性對(duì)照(去丁香)；1.丁香酚；2.和厚樸酚；3.木香烴內(nèi)酯；4.去氫木香烴內(nèi)酯；5.厚樸酚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative control(missingRadixaucklandiae)；D.negative control(missingCortexmagnoliaeOfficinalis)；E.negative control(missingFloscaryophylli)；1.eugenol；2.honokiol；3.costunolide；4.dehydrocostuslactone；5.magnolol.

2.3線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液1，2，5，10，20和50 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的回歸方程分別為：y1=5.39×106x1-34 535(r1=0.999 95)，y2=9.01×106x2+101 257(r2=0.999 96)，y3=1.10×107x3+15 487(r3=0.999 94)，y4=4.49×106x4+2 206(r4=0.999 97)，y5=3.59×106x5+6 835(r5=0.999 93)。結(jié)果表明，丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯分別在0.066～3.281，0.034～1.692，0.020～0.982，0.025～1.264和0.027～1.374 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為150501的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)得丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.83%，1.02%，0.37%，0.52%和0.54%(n=6)，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為150501的供試品溶液，分別于0，2，4，6，8和12 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的RSD值分別為0.96%，1.39%，0.59%，0.68%和1.13%(n=6)，表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為150501的供試品6份，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，測(cè)得丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯含量的RSD值分別為1.22%，1.35%，0.87%，0.89%和1.11%(n=6)，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為150501的供試品6份，每份3 g，加硅藻土適量，研勻，置于具塞三角瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度為50.21，43.49，52.67，21.73和31.47 μg·mL-1的丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯混合對(duì)照品乙醚溶液7.5，15和22.5 mL，按照2.2項(xiàng)下方法制備，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1加樣回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Determination results of recovery tests

成分序號(hào)樣品含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%丁香酚10.752 80.376 61.117 996.9598.321.3120.754 30.376 61.118 796.7630.757 40.753 21.497 598.2640.752 10.753 21.501 399.4750.748 91.129 71.861 698.5060.751 01.129 71.880 199.95厚樸酚10.663 80.326 20.991 3100.4099.761.1320.667 40.326 20.997 6101.2330.662 10.652 41.302 198.1040.661 40.652 41.315 4100.2550.659 70.978 51.627 098.8660.663 60.978 51.639 199.69和厚樸酚10.791 90.395 01.187 2100.0899.821.3720.793 50.395 01.195 1101.6730.792 30.790 01.580 199.7240.795 80.790 01.574 398.5450.789 51.185 11.951 498.0460.792 71.185 11.987 8100.84木香烴內(nèi)酯10.323 50.163 00.483 598.1699.511.0220.326 00.163 00.488 799.8230.321 70.326 00.650 2100.7740.322 40.326 00.643 498.4750.319 50.488 90.809 7100.2760.324 30.488 90.811 299.59去氫木香烴內(nèi)酯10.468 20.236 00.698 297.4698.841.1520.467 70.236 00.702 799.5830.468 90.472 00.930 797.8440.469 10.472 00.932 698.2050.464 10.708 11.171 599.9060.471 50.708 11.180 1100.07

2.8樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的供試品各2份，依照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Results of sample assay

批號(hào)丁香酚/mg·g-1厚樸酚/mg·g-1和厚樸酚/mg·g-1木香烴內(nèi)酯/mg·g-1去氫木香烴內(nèi)酯/mg·g-11505010.246 30.224 10.261 90.103 50.154 41507020.268 70.236 40.256 20.117 60.160 51511010.283 20.257 50.300 20.159 30.122 3

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別比較甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿和乙醚作為提取溶劑的差別。結(jié)果表明，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿和乙醚作為提取溶劑樣品中5種指標(biāo)成分峰面積差異不大，考慮到以乙醚提取甲醇溶解可有效除去樣品雜質(zhì)，提高分離度，故選用乙醚提取甲醇溶解。

3.2提取方法和超聲時(shí)間的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別比較了加熱回流提取1 h和超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min的2種前處理?xiàng)l件，結(jié)果提取率無(wú)顯著差異，因回流提取步驟繁瑣，操作過(guò)程中易造成成分損失，而超聲提取方法簡(jiǎn)便，故選用超聲處理?xiàng)l件。同時(shí)分別考察了超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)15，30，45和60 min的提取效果，結(jié)果超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min已提取完全，最終選擇超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min為最優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

3.3流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇-水、乙腈-水和甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相，考察了樣品分離效果，結(jié)果采用甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)可使5種指標(biāo)成分完全分離，陰性無(wú)干擾，且在此流動(dòng)相條件下指標(biāo)成分峰形良好，能夠滿足相應(yīng)成分的分析要求。

3.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯對(duì)照品流動(dòng)相溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～380 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，圖譜顯示，丁香酚在209，235和284 nm處有最大吸收，厚樸酚與和厚樸酚在210和294 nm處有最大吸收，木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯在210和225 nm處有最大吸收，故選用210 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

4 小結(jié)

本文對(duì)十香止痛丸方中的丁香、厚樸和木香3味中藥中5種成分采用HPLC法同時(shí)測(cè)定含量，能夠較全面地控制該制劑質(zhì)量，且方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。