HPLC法同時測定頸腦康丸中4種活性成分的含量

李道明，程 偉

(信陽市食品藥品檢驗所，信陽 464000)

頸康方是信陽市中醫(yī)院名老中醫(yī)高國舉從醫(yī)40余年用于治療頸椎病及腦血管病的常用方劑，療效顯著，后改為頸腦康丸，臨床觀察有效率達95%以上，療效比之湯藥未見差別，且較之湯藥服用方便、便于攜帶，深受患者歡迎。本方由黃芪、丹參、當歸、赤芍、葛根、威靈仙和紅花等13味中藥組成，具有益氣活血、通經活絡的功效，臨床主治頸椎病、腦梗死、腦血管病后遺癥及血管性腦供血不足等。黃芪為方中君藥，具有補氣升陽、生津養(yǎng)血的功效，在免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病和延緩衰老等方面具有重要作用[1]。當歸對神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)也有作用，并具有抗腫瘤、抗輻射、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化和抗衰老等作用[2]。丹參具有擴張冠狀動脈、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環(huán)以及降低心肌耗氧量等作用[3]。赤芍在血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)等均表現(xiàn)出良好的藥理作用[4]。芍藥苷具有調節(jié)血脂和血壓等作用，可用于治療神經退行性疾病、心血管疾病和糖尿病并發(fā)癥等多種疾病[5]。周修森等[6]采用HPLC-ELSD法測定頸腦康丸中黃芪甲苷的含量，而本文以阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷為指標成分，建立測定4種活性成分的HPLC法，為控制該制劑的質量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；梅特勒-托利多XSE105十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司)；SB-5200DT超聲波提取器(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2試藥 阿魏酸對照品(批號110773-201614)、丹酚酸B對照品(批號111562-201514)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號111920-201304)和芍藥苷對照品(批號110736-201640)，均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純(美國天地公司)；水為超純水；其余試劑為分析純；頸腦康丸(信陽市中醫(yī)院，批號：20160512，20160925，20161106)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：BDS-Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)系統(tǒng)；梯度洗脫(0～45 min，乙腈比例15%～30%)；檢測波長：0～9 min檢測芍藥苷為230 nm，9～11 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷為260 nm，11～15 min檢測阿魏酸為316 nm，15～45 min檢測丹酚酸B為286 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芍藥苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為18.69，89.28，18.40和90.00 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取樣品2 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密量取體積分數(shù)為75%的甲醇30 mL，密塞后稱定質量，超聲提取30 min，冷卻后用體積分數(shù)為75%的甲醇補足減失的質量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 按照處方比例和制備工藝分別制備不含當歸、丹參、黃芪和赤芍的陰性樣品，再按照2.2.2項下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.3專屬性考察 取2.2項下制備的混合對照品溶液、供試品溶液和4種陰性樣品溶液各10 μL，在2.1項色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，供試品色譜圖中在與對照品色譜圖上相應的位置有相同的色譜峰，且陰性樣品無干擾。

圖1HPLC圖

A.混合對照品；B.供試品；C.缺當歸的陰性樣品；D.缺丹參的陰性樣品；E.缺黃芪的陰性樣品；F.缺赤芍的陰性樣品；1.芍藥苷；2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；3.阿魏酸；4.丹酚酸B。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixture of reference substances；B.sample；C.ChinsesAngelicanegative reference sample；D.Salviamiltiorrhizanegative reference sample；E.Astragalusmembranaceusnegative reference sample；F.RadixPaeoniaerubranegative reference sample；1.paeoniflorin；2.calycosin-7-O-β-D-glycoside；3.ferulic acid；4.salvianolic acid B.

2.4線性關系考察 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品溶液1，2，5，10和20 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。分別以阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的進樣量為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，得到阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的回歸方程分別為y1=4.925x1+0.588(r1=0.999 9)，y2=1.090x2+0.940(r2=0.999 9)，y3=2.955x3+15.348(r3=0.999 7)和y4=1.232x4+14.630(r4=0.999 9)。結果表明，阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的進樣量分別在18.69～373.76，89.28～1 785.60，18.40～368.00和90.00～1 800.00 ng范圍內線性關系良好。

2.5精密度實驗 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果得到阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.62%，1.02%，0.87%和1.15%(n=6)，結果表明，該儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在放置0，2，4，8，12和24 h后進樣10 μL，按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.32%，0.58%，0.75%和1.26%(n=6)，結果表明，24 h內供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.7重復性實驗 平行稱取同一批(批號20160512)頸腦康丸，6份，每份2 g，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的含量。結果4種成分的平均含量分別為0.104，1.775，0.089和2.126 mg·g-1，RSD值分別為1.52%，0.94%，1.81%和0.64%(n=6)，結果表明，該方法重復性良好。

2.8加樣回收率實驗 精密稱取同一批含量的頸腦康丸(批號20160512)的樣品粉末6份，每份1 g，分別加入阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷對照品的混合溶液Ⅱ(質量濃度依次為3.488，58.320，2.968和71.100 μg·mL-1)30 mL，按照2.2.2項下方法制備加樣供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算各成分回收率。結果表明，阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的平均加樣回收率分別為98.99%(RSD=0.82%)，99.30%(RSD=0.64%)，98.90%(RSD=1.14%)和98.98%(RSD=0.88%)(n=6)。

2.9樣品的含量測定 取3批頸腦康丸，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，根據(jù)2.4項下得到的標準曲線方程計算各成分的含量，結果見表1。

表1樣品含量測定結果

Tab.1 Results of content determination (mg·g-1，n=3)

3 討論

3.1流動相的選擇 本實驗分別先后考察甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液和乙腈-水3種不同組成的流動相系統(tǒng)。甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液作為流動相時，色譜峰有部分重疊，分離不完全，且丹酚酸B洗脫時間過長；乙腈-水作為流動相進行洗脫時，分離度較好，但峰形不理想；而以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液進行梯度洗脫時，各峰分離度較好，峰形也較為美觀，適應實驗要求，故本研究采用此流動相系統(tǒng)。

3.2波長的選擇 本研究在檢測波長參數(shù)方面，參考現(xiàn)有相關文獻目標成分[7-10]，采用不同時間段變換不同波長[11-12]，以各目標成分的特征吸收來保障其準確性，因此按照不同時間段設置波長參數(shù)：0～9 min檢測芍藥苷為230 nm，9～11 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷為260 nm，11～15 min檢測阿魏酸為316 nm，15～45 min檢測丹酚酸B為286 nm。

3.3指標成分的選擇 阿魏酸能抑制急性腦梗死患者的血小板聚集，改善血液循環(huán)，改善患者的生活質量[13]。丹酚酸B可削弱活化血小板誘導的CMEC炎癥介質的表達，對腦血管內炎癥級聯(lián)反應起到抑制作用，亦對腦MIRI所致線粒體損傷和神經細胞凋亡有明顯抑制作用[14]。同時大量研究已證實丹酚酸B對多種心血管疾病如心肌梗死、動脈粥樣硬化及心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用[15]。黃芪中的黃酮類成分作為黃芪藥材的主要成分之一，具有抗心肌缺血、抗腫瘤、抗損傷、抗炎和抗突變等多種藥理作用[16-19]。研究表明，芍藥苷有望發(fā)展為安全、有效、可長期反復服用的抗缺血性腦卒中的藥物[20]。