頂空氣相色譜法測(cè)定頭孢唑蘭原料藥中的5種有機(jī)溶劑殘留量

易夢(mèng)娟，許 軍，劉燕華，王 晨，田太平，李豫園

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004)

頭孢唑蘭(cefozopran)是由日本武田公司最先研究開發(fā)的第四代注射用頭孢菌素[1-4]。頭孢唑蘭對(duì)葡萄球菌和銅綠假單胞菌等革蘭陽性菌及厭氧菌均顯示廣譜抗菌活性，頭孢唑蘭的毒性很低[5-6]，臨床可用于新生兒和低體質(zhì)量患者難治性重癥感染的治療[7-9]。其化學(xué)名稱是1-[[(6R，7R)-7-[(Z)-2-(5-氨基-1，2，4-噻二唑-3-基)-2-(甲氧亞氨基)乙酰氨基]-2-羧基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4，2，0]辛-2-烯-3-基]甲基]咪唑并[1，2-b]噠嗪鎓內(nèi)鹽鹽酸鹽[8]，結(jié)構(gòu)式見圖 1。由于頭孢唑蘭合成過程中使用了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯等揮發(fā)性溶劑，為了有效控制藥品的質(zhì)量，保證用藥安全，依據(jù)《中國藥典》2015年版四部中殘留溶劑測(cè)定法[10]和文獻(xiàn)方法[11-16]，建立了頂空氣相色譜法測(cè)定頭孢唑蘭中5種揮發(fā)性溶劑殘留量的方法。該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于實(shí)際生產(chǎn)中產(chǎn)品殘留有機(jī)溶劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 7890B型氣相色譜儀和Agilent 7697A頂空進(jìn)樣器(安捷倫科技(中國)有限公司)；BS124S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

1.2試藥 頭孢唑蘭(自制，批號(hào)：20160501，20160502，20160503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.0%)；溶劑二甲基亞砜(DMSO)為色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；對(duì)照品甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)。

圖1頭孢唑蘭的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1 The chemical structure of cefozopran

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：DB-624毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，1.8 μm)；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；FID檢測(cè)器溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃，維持5 min，以20 ℃·min-1升溫至220 ℃，維持10 min；載氣：高純氮?dú)?；流量?.0 mL·min-1。

頂空條件：頂空平衡溫度：90 ℃；平衡時(shí)間：30 min；進(jìn)樣體積：1 mL；定量環(huán)溫度：120 ℃；傳輸線溫度：130 ℃；分流進(jìn)樣，分流比：20∶1。

2.2溶液的制備 混合對(duì)照品溶液：分別精密量取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯59.7，120.9，31.7，120.8和29.4 mg，置于50 mL量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取供試品(批號(hào)20160501)100 mg，精密稱定，置于20 mL頂空瓶中，精密加入2 mL二甲基亞砜，加蓋密封，室溫下超聲溶解1 min，即得。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果測(cè)得甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，符合要求，其保留時(shí)間分別為4.035，5.403，6.096，6.780和8.378 min，色譜圖見圖2。

2.4線性關(guān)系、定量限與檢測(cè)限考察 精密吸取5 mL 2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，置于10 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液②；精密吸取對(duì)照品溶液②5 mL，置于10 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液③；精密吸取對(duì)照品溶液③5 mL，置于10 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液④；精密吸取對(duì)照品溶液④5 mL，置于10 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液⑤；精密吸取對(duì)照品溶液⑤5 mL，置于10 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液⑥；取樣2.0 mL，置于20 mL頂空瓶中，密封。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。各對(duì)照品溶液進(jìn)樣2次，計(jì)算各溶劑的平均值。分別以5種殘留溶劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，建立回歸方程；結(jié)果見表1。

圖2GC圖

A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.空白溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.丙酮；4.二氯甲烷；5.乙酸乙酯；6.二甲基亞砜。

Fig.2 GC chromatograms

A.mixed control；B.sample；C.blank control；1.methanol；2.ethanol；3.acetone；4.dichloromethane；5.ethyl acetate；6.dimethyl sulfoxide.

將上述對(duì)照品溶液⑤依次用二甲基亞砜稀釋，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=3計(jì)算檢測(cè)限，以信噪比S/N=10計(jì)算定量限。結(jié)果見表1。

表15種有機(jī)溶劑的線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

Tab.1 The linear relationship，limit of detection and quantitation of 5 kinds of organic solvents (n=2)

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液2.0 mL，置于20 mL頂空瓶中，密封，按照2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分別為2.09%，1.92%，1.79%，1.93%和2.21%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知各溶劑含量的頭孢唑蘭原料藥(批號(hào)20160501)共9份，每份0.1 g，置于10 mL量瓶中，第1～3份分別加入混合對(duì)照品溶液1.6 mL，第4～6份分別加入混合對(duì)照品溶液2 mL，第7～9份分別加入混合對(duì)照品溶液2.4 mL，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取樣2.0 mL，置于頂空進(jìn)樣瓶中，密封，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取2.0 mL 2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，置于20 mL頂空瓶中，密封，共6份，分別于0，2，4，6，8和10 h，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算出甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分別為2.75%，3.50%，3.73%，3.57%和4.19%(n=6)，結(jié)果表明，混合對(duì)照品溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8樣品測(cè)定 取3批樣品(批號(hào)：20160501，20160502，20160503)各適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并以外標(biāo)法計(jì)算甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的殘留量，結(jié)果3批樣品殘留量均符合《中國藥典》規(guī)定殘留溶劑限量要求。見表3。

表25種溶劑回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Recovery test results of 5 kinds of solvents (n=9)

表3樣品測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Results of content determination of samples (n=3)

注： —表示未檢出。

3 討論

3.1溶解介質(zhì)的選擇 對(duì)于頂空進(jìn)樣，一般都選用水作為溶劑，水的溶解性較好，在氫火焰離子化檢測(cè)器上無響應(yīng)，對(duì)分析系統(tǒng)無污染；對(duì)不溶或微溶于水的溶劑，一般選擇二甲基亞砜或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。經(jīng)過溶解性實(shí)驗(yàn)表明，頭孢唑蘭難溶于水，且DMSO的沸點(diǎn)較高，在被測(cè)組分之后出峰，不干擾殘留溶劑的測(cè)定，故選擇DMSO作為溶劑。

3.2色譜柱的選擇 選擇色譜柱時(shí)，需考慮固定相、柱內(nèi)徑、膜厚和長(zhǎng)度等因素。固定相的選擇可遵循相似相溶基本原理；柱內(nèi)徑、膜厚和長(zhǎng)度的選擇依據(jù)樣品質(zhì)量濃度和儀器而定；對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的頭孢唑蘭組分簡(jiǎn)單，使用30 m、內(nèi)徑小、薄液膜的色譜柱，可縮短分析時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)分別考察了DB-624和HP-5毛細(xì)管色譜柱，其中DB-624為中等極性色譜柱，適用于碳?xì)浠衔铩⑾N、醇類、酯類、醚類、含氮溶劑和殘留溶劑等的測(cè)定，HP-5為非極性毛細(xì)管色譜柱，適用于半揮發(fā)性化合物、生物堿、鹵代化合物和脂肪酸甲酯等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)比HP-5非極性色譜柱，DB-624中等極性色譜柱測(cè)定時(shí)，各有機(jī)溶劑均能達(dá)到有效分離，且峰形較好，因此本實(shí)驗(yàn)最終選用DB-624毛細(xì)管色譜柱。

3.3頂空平衡溫度的選擇 待測(cè)殘留溶劑甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的沸點(diǎn)分別為64.7，78.3，56.5，39.75和77 ℃，所測(cè)溶劑的沸點(diǎn)均不高于80 ℃。本實(shí)驗(yàn)選擇了頂空平衡溫度80與90 ℃考察，平衡時(shí)間均為30 min。在平衡溫度為90 ℃時(shí)，各溶劑均達(dá)到最高響應(yīng)值，且色譜圖各峰峰形、分離度均能達(dá)到要求。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇頂空平衡溫度為90 ℃。

3.4測(cè)定結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部殘留溶劑及限度的有關(guān)規(guī)定[10]，本實(shí)驗(yàn)中殘留溶劑的限度甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯分別不得超過0.3%，0.5%，0.5%，0.06%和0.5%，根據(jù)樣品測(cè)定結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的樣品中殘留溶劑的含量均在限度范圍內(nèi)，檢驗(yàn)結(jié)果均符合有關(guān)規(guī)定。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于生產(chǎn)企業(yè)及其有關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)頭孢唑蘭原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制。