薄殼山核桃種仁中酚類成分含量和抗氧化能力差異分析及優(yōu)株篩選

羅會婷， 許夢洋， 賈曉東，2，①， 翟 敏， 李永榮， 宣繼萍， 張計育， 郭忠仁，①

〔1. 江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院， 江蘇 南京 210095； 3. 南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司， 江蘇 南京 210007〕

薄殼山核桃〔Caryaillinoinensis(Wangenh.) K. Koch〕又名美國山核桃、長山核桃等，起源于美國和墨西哥交界處的河谷地帶[1]。薄殼山核桃作為商品化作物僅百余年，但其引入中國的時間已有110多年[2]。迄今為止，中國已有20多個省(自治區(qū)、直轄市)引種并種植該樹種。薄殼山核桃種仁營養(yǎng)豐富，尤其富含油脂及人體所需的多種營養(yǎng)成分，既是著名的干果樹種，也是重要的木本油料樹種。

酚類成分廣泛存在于植物體中，主要包括黃酮類和縮合單寧類[3]。對于薄殼山核桃中酚類成分的研究始于20世紀。早在20世紀80年代初，Senter等[4]利用氣相色譜法從薄殼山核桃品種‘Stuart’和‘Schley’的種仁中檢測出沒食子酸及水楊酸衍生物；隨著檢測儀器和實驗方法的提升，人們陸續(xù)在薄殼山核桃的種仁或殼中發(fā)現(xiàn)兒茶素、表兒茶素和鞣花酸等酚類成分[5-8]。Wu等[9]對比了薄殼山核桃與多種蔬菜和堅果，發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃的總酚含量最高且抗氧化能力最強。相關(guān)研究結(jié)果[10-13]還表明：酚類成分能夠降低多種慢性疾病的發(fā)病率，如阿爾茨海默病、帕金森綜合征、癌癥和變性疾病等。

傳統(tǒng)的薄殼山核桃育種目的局限于提高產(chǎn)量、增強抗性和完善果形等方面，但以提升營養(yǎng)水平為目的選育工作目前尚未受到重視。作者在前期主要針對薄殼山核桃的果實性狀和種仁脂肪酸含量開展了部分選育工作[14]，在此基礎(chǔ)上，作者依據(jù)總黃酮、縮合單寧、總酚、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸含量及總酚提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力10個指標，對南京地區(qū)76株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量及抗氧化能力進行了比較分析，以期篩選出高酚類含量及高抗氧化能力的薄殼山核桃優(yōu)良單株，為薄殼山核桃優(yōu)良品種選育提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2015年10月至11月在江蘇省南京市的南京中山植物園以及雨花臺和明孝陵景區(qū)采收薄殼山核桃實生單株的成熟果實。選擇樹齡50～60 a、樹體強健(株高20 m以上、胸徑50 cm以上)且少病蟲害的76株樣株進行采種；采用升降機輔助、人工敲落的方法從樹體中部的各個方位采集果實，每株采集約1 kg，將各樣株的果實分為3個生物學重復；同時，按1至76順序?qū)Σ煞N樣株和果實樣本同步編號，便于翌年持續(xù)觀測和采種。

主要儀器包括Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、UV-5100型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)、EFAA-DC12氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)和YRE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

主要試劑：沒食子酸(GA，純度大于等于98%)、兒茶素(CE，純度大于等于98%)、表兒茶素(ECE，純度大于等于98%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度大于等于98%)和鞣花酸(EAE，純度大于等于98%)5種酚類化合物標準品均購自南京春秋生物工程有限公司；香草醛(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；福林酚試劑購自美國Sigma-Aldrich公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2′-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽購自美國Sigma-Aldrich公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-甲酸(trolox)購自東京化成工業(yè)株式會社；甲醇(色譜純)、丙酮(分析純)和乙腈(色譜純)購自南京壽德試劑器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脫脂和總酚提取 人工去除果實外殼，取種仁供試。將種仁置于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，采用索氏提取法[15]提取油脂；脫脂后的種仁于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，碾磨成粉末后用錫箔紙密封包裝，于-20 ℃保存、備用。

總酚提取參考文獻[6，8]的方法并稍加修改。稱取約1.000 g脫脂種仁粉末，加入20 mL體積分數(shù)80%丙酮作為提取溶劑，浸提12 h，超聲(功率100 W，室溫)提取2 h；過濾，殘渣加入20 mL體積分數(shù)80%丙酮超聲提取30 min；過濾，合并2次濾液于50 ℃水浴，氮氣吹干；加入10 mL甲醇溶解殘渣，于-20 ℃保存、備用。

1.2.2 總黃酮含量測定 總黃酮含量測定參考文獻[16]的方法并稍加修改。準確稱取0.100 g兒茶素，用甲醇定容至25 mL，得到4 000 μg·mL-1兒茶素標準品母液；用甲醇逐級稀釋至3 600、2 800、2 400、2 000、1 600、1 200、800和400 μg·mL-1。測定吸光值，并以兒茶素質(zhì)量濃度為自變量(x)、吸光值為因變量(y)繪制標準曲線。兒茶素標準曲線為y=0.000 5x+0.013 8(R2=0.999 1)。

根據(jù)上述兒茶素標準曲線計算各樣品的總黃酮含量；結(jié)果以1 g鮮種仁中含有的兒茶素等價物的質(zhì)量計。

1.2.3 縮合單寧含量測定 縮合單寧含量測定參考文獻[6]的方法并稍加修改。準確稱取0.200 g兒茶素，用甲醇定容至5 mL，得到40 mg·mL-1兒茶素標準品母液；用甲醇逐級稀釋至40、36、32、28、24、20、16、8和4 mg·mL-1。測定吸光值，并以兒茶素質(zhì)量濃度為自變量(x)、吸光值為因變量(y)繪制標準曲線。兒茶素標準曲線為y=0.000 05x+0.294 40(R2=0.999 00)。

根據(jù)上述兒茶素標準曲線計算各樣品的縮合單寧含量；結(jié)果以1 g鮮種仁中含有的兒茶素等價物的質(zhì)量計。

1.2.4 總酚含量測定 總酚含量測定參照文獻[6]采用福林酚試劑法。準確稱取40 mg鞣花酸，用甲醇定容至10 mL，得到4 000 μg·mL-1鞣花酸標準品母液；用甲醇逐級稀釋至3 600、3 200、2 800、2 400、2 000和1 600 μg·mL-1。測定吸光值，并以鞣花酸質(zhì)量濃度為自變量(x)、吸光值為因變量(y)繪制標準曲線。鞣花酸標準曲線為y=0.000 1x+0.122 7(R2=0.999 9)。

根據(jù)上述鞣花酸標準曲線計算各樣品的總酚含量，結(jié)果以1 g鮮種仁中含有的鞣花酸等價物的質(zhì)量計。

1.2.5 5種酚類化合物含量測定 參照文獻[17]設(shè)置高效液相色譜(HPLC)條件：Gemini色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速1.0 mL·min-1；流動相A為體積分數(shù)2%乙酸，流動相B為體積分數(shù)100%乙腈；洗脫流程為5%～37%B(0～40 min)，37%～5%B(40～41 min)，5%B(41～50 min)；柱溫35 ℃，檢測波長250 nm，進樣量10 μL。每個樣品測定3次。

準確稱取沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸各1 mg，分別用甲醇定容至10 mL，得到0.1 mg·mL-1相應的標準品母液；分別用甲醇逐級稀釋至0.050 0、0.025 0、0.016 6、0.012 5和0.010 0 mg·mL-1，按上述色譜條件進樣測定。以各標準品的質(zhì)量濃度為自變量(x)、峰面積為因變量(y)分別繪制標準曲線。沒食子酸標準曲線為y= 1 274 302.173 9x+ 9.200 7 (R2=0.999 9)；兒茶素標準曲線為y=145 650.000 0x+1.500 0(R2=0.999 7)；表兒茶素標準曲線為y=131 850.000 0x+4.090 0(R2=0.998 4)；表沒食子兒茶素沒食子酸酯標準曲線為y=537 500.000 0x+7.750 0(R2=0.997 9)；鞣花酸標準曲線為y=9 766 750.000 0x+107.650 0(R2=0.999 5)。

按照上述色譜條件對樣品總酚提取液進樣測定，并根據(jù)上述各標準品的標準曲線分別計算各樣品中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸的含量，結(jié)果以1 g鮮種仁中含有的各成分的質(zhì)量計。

1.2.6 DPPH·和ABTS+·清除能力測定 總酚提取液對DPPH·清除能力的測定參考文獻[18]的方法并稍加修改；總酚提取液對ABTS+·清除能力的測定參考文獻[17]的方法并稍加修改。準確稱取0.100 g trolox，用甲醇定容至25 mL，得到4 000 μg·mL-1trolox標準品母液，再用甲醇逐級稀釋至2 000、1 000、500、250和125 μg·mL-1。測定吸光值，并以trolox標準品的質(zhì)量濃度為自變量(x)、吸光值為因變量(y)分別繪制標準曲線。DPPH·清除能力標準曲線為y=-0.000 2x+0.937 7(R2=0.999 7)；ABTS+·清除能力標準曲線為y=-0.001 4x+1.667 2(R2=0.999 8)。

根據(jù)上述trolox標準品曲線計算各樣品對DPPH·和ABTS+·清除能力，結(jié)果以1 g鮮種仁中含有的trolox等價物的量計。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用EXCEL 2007和SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 酚類成分含量及抗氧化能力差異分析

對供試76株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量及總酚提取物抗氧化能力的差異進行分析，結(jié)果見表1。

表176株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量及總酚提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力的統(tǒng)計分析

Table1StatisticalanalysisonphenolicscontentandscavengingabilitiesoftotalphenolicextractstoDPPH·andABTS+·fromkernelof76individualsofCaryaillinoinensis(Wangenh.)K.Koch

統(tǒng)計量1)Statistic1)含量/(mg·g-1) Content清除能力/(μmol·g-1)Scavenging ability總黃酮Total flavonoids縮合單寧Condensed tannins總酚Total phenolics沒食子酸Gallic acid兒茶素(+)-catechin表兒茶素 (-)-epicatechinEGCG2)鞣花酸Ellagic acidDPPH·ABTS+·X3.0818.6511.730.091.390.900.531.03249.61207.77Max7.0449.1626.660.283.224.141.462.69618.04382.99Min1.456.785.410.020.330.010.020.3941.0963.32SD1.057.483.720.040.800.810.270.53110.1872.30CV/%34.2240.1131.7548.9957.7790.2650.7251.1844.1434.80

2)EGCG： 表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (-)-epigallocatechin gallate.

由表1可見：供試76株單株種仁中總黃酮含量為1.45～7.04 mg·g-1，平均值為3.08 mg·g-1；縮合單寧含量為6.78～49.16 mg·g-1，平均值為18.65 mg·g-1；總酚含量為5.41～26.66 mg·g-1，平均值為11.73 mg·g-1。5種酚類化合物中，兒茶素含量最高，平均值為1.39 mg·g-1；鞣花酸含量次之，平均值為1.03 mg·g-1；沒食子酸含量最低，平均值為0.09 mg·g-1。總酚提取物對DPPH·清除能力為41.09～618.04 μmol·g-1，平均值為249.61 μmol·g-1；而總酚提取物對ABTS+·清除能力為63.32～382.99 μmol·g-1，平均值為207.77 μmol·g-1。

由表1還可見：供試76株單株種仁中酚類成分含量及總酚提取物的抗氧化能力差異明顯，變異系數(shù)達到31.75%～90.26%?？傸S酮、縮合單寧和總酚含量的變異系數(shù)分別為34.22%、40.11%和31.75%；沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸5種酚類化合物含量的變異系數(shù)均在48%以上，其中，表兒茶素含量的變異系數(shù)高達90.26%?？偡犹崛∥飳PPH·和ABTS+·清除能力的變異系數(shù)則分別為44.14%和34.80%。

2.2 高酚類含量和高抗氧化能力的優(yōu)株篩選

依據(jù)種仁中總黃酮、縮合單寧、總酚、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸含量以及總酚提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力10個指標，從供試76株薄殼山核桃單株中分別篩選出排名前10的單株，結(jié)果見表2。

由表2可見：供試76株單株中，70號、30號、23號和29號單株種仁中總黃酮、縮合單寧和總酚含量均排名前10。70號單株種仁中總黃酮、縮合單寧和總酚含量均排名第1，分別為7.04、49.16和26.66 mg·g-1，均與其他單株有顯著(P<0.05)差異；30號單株種仁中總黃酮和總酚含量排名第2，其縮合單寧含量排名第3，分別為6.22、22.31和34.15 mg·g-1。此外，23號單株種仁中總黃酮、縮合單寧和總酚含量分別為5.85、31.10和21.71 mg·g-1，分別排名第3、第5和第3；29號單株種仁中總黃酮、縮合單寧和總酚含量分別為4.69、31.60和17.45 mg·g-1，分別排名第5、第4和第6。此外，63號、20號和54號單株種仁中總黃酮和縮合單寧含量也均較高，均排名前10；而2號單株種仁中總黃酮和總酚含量也均排名前10，其中總酚含量僅次于70號、30號和23號。

供試76株單株中，僅18號單株種仁中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸含量均排名前10，分別排名第5、第5、第10、第3和第3。沒食子酸含量排名前4的單株為70號、4號、29號和30號單株；兒茶素含量排名前4的單株為66號、34號、70號和44號單株；表兒茶素含量排名前4的單株為30號、70號、23號和20號單株；表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量排名前4的單株為4號、48號、18號和66號單株；鞣花酸含量排名前4的單株為30號、70號、18號和49號單株。其中，70號單株的沒食子酸含量排名第1(0.99 mg·g-1)，其兒茶素、表兒茶素和鞣花酸含量也均排名前3；30號單株的表兒茶素和鞣花酸含量均排名第1，分別為14.07和9.11 mg·g-1，其沒食子酸含量也較高，排名第4。另外，4號單株的表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量排名第1，其沒食子酸、兒茶素和鞣花酸含量也均排名前10。

排名Ranking單株編號No. of individualC1/(mg·g-1)單株編號No. of individualC2/(mg·g-1)單株編號No. of individualC3/(mg·g-1)單株編號No. of individualC4/(mg·g-1)單株編號No. of individualC5/(mg·g-1)1707.04±0.24a7049.16±0.99a7026.66±0.08a700.99±0.01a6622.27±0.42a2306.22±0.26b6334.25±1.13b3022.31±0.32b40.72±0.01b3412.26±0.32b3235.85±0.32c3034.15±0.32b2321.71±0.27b290.60±0.01bc7011.60±0.37b4105.30±0.41cd2931.60±0.95bc217.81±0.17d300.56±0.01c449.95±0.21c5294.69±0.35d2331.10±0.37c5717.81±0.08d180.55±0.01c189.35±0.25c6634.57±0.23d1030.60±1.26c2917.45±0.08d140.55±0.01c129.23±0.31c7204.35±0.25d5430.08±0.21cd2615.71±0.12e260.52±0.01c768.98±0.18cd8544.32±0.31de5929.14±0.87d1815.53±0.06e340.50±0.01cd77.89±0.20d9494.04±0.25e2029.11±1.02d5115.36±0.19e200.48±0.01cd627.82±0.19d1024.00±0.05e7227.66±0.27e2215.02±0.12e560.45±0.01d47.68±0.29d排名Ranking單株編號No. of individualC6/(mg·g-1)單株編號No. of individualC7/(mg·g-1)單株編號No. of individualC8/(mg·g-1)單株編號No. of individualSA1/(μmol·g-1)單株編號No. of individualSA2/(μmol·g-1)13014.07±0.46a45.20±0.26a309.11±0.33a70618.04±2.90a30382.99±5.85a 27012.89±0.31b484.87±0.20a707.16±0.24b62468.78±1.47b70348.03±12.31b32312.60±0.27b184.67±0.13a186.99±0.16b69468.16±1.98b20342.70±1.90bc4209.32±0.25c664.22±0.15ab496.80±0.32b63444.29±3.04c62335.95±13.17c5298.96±0.32cd193.48±0.16b46.71±0.26b56417.94±1.48d10335.64±9.23c6417.12±0.31d163.31±0.28b296.14±0.43bc72415.16±2.46d11329.18±7.20d7167.01±0.26d393.17±0.20b576.00±0.29c21410.72±3.65de46319.35±5.90e8666.01±0.19e93.09±0.21b445.80±0.17cd58387.29±1.68e34310.15±4.61f9625.13±0.19ef12.99±0.35b235.56±0.31cd54385.86±1.52e69303.32±15.93gh10184.85±0.20f332.91±0.14b75.22±0.24d34383.34±1.13e18295.61±13.07h

1)C1： 總黃酮含量 Content of total flavonoids； C2： 縮合單寧含量 Content of condensed tannins； C3： 總酚含量 Content of total phenolics； C4： 沒食子酸含量Content of gallic acid； C5： 兒茶素含量Content of (+)-catechin； C6： 表兒茶素含量Content of (-)-epicatechin； C7： 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量Content of (-)-epigallocatechin gallate； C8： 鞣花酸含量Content of ellagic acid； SA1： DPPH·清除能力Scavenging ability to DPPH·； SA2： ABTS+·清除能力Scavenging ability to ABTS+·. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

總酚提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力均排名前10的單株為70號、62號、69號和34號單株。其中，70號單株的DPPH·和ABTS+·清除能力分別排名第1和第2，分別達到618.04 和348.03 μmol·g-1；62號單株的這2個抗氧化能力指標也均排名前4；30號單株的ABTS+·清除能力排名第1(382.99 μmol·g-1)，且顯著高于其他單株。

總體上看，70號單株種仁中，除表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量外，其他9個指標均排名前3，其中，5個指標排名第1，3個指標排名第2，1個指標排名第3，說明70號單株不論是在酚類成分含量還是抗氧化能力方面均具有明顯優(yōu)勢，可作為高酚類含量和高抗氧化能力的雙優(yōu)株。若以高酚類含量作為篩選目標，則除70號單株外，30號和29號單株也有6個酚類成分含量指標排名前6，可作為高酚類含量的優(yōu)選單株。若以高抗氧化能力作為篩選目標，則除70號單株外，62號、69號和34號單株的2個抗氧化能力指標均排名前10，可作為高抗氧化能力的優(yōu)選單株。

2.3 果實和種仁不同性狀間的相關(guān)性分析

2.3.1 種仁中酚類成分含量及總酚提取物抗氧化能力間的相關(guān)性分析 對供試76株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量及總酚提取物抗氧化能力的10個指標間進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

由表3可見：供試76株單株種仁中總黃酮含量、縮合單寧含量和總酚含量三者間均呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，其中，總酚含量與總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)最大(0.909)，縮合單寧含量與總黃酮含量以及總酚含量與縮合單寧含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.877和0.803；5種酚類化合物中，僅表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量與其他化合物的含量呈不顯著相關(guān)，其他4種酚類化合物的含量總體上均呈極顯著正相關(guān)；另外，表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量與總黃酮含量、縮合單寧含量和總酚含量呈不顯著負相關(guān)，兒茶素含量與縮合單寧含量呈不顯著正相關(guān)，其他4種酚類化合物的含量與總黃酮含量、縮合單寧含量和總酚含量呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(guān)。

總黃酮含量、縮合單寧含量、總酚含量與總酚提取物對DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力均呈極顯著正相關(guān)，其中，縮合單寧含量與總酚提取物對DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力的相關(guān)系數(shù)最大，分別為0.512和0.480。5種酚類化合物中，除表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量外，其他4種酚類化合物的含量與總酚提取物對DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力總體上均呈顯著或極顯著正相關(guān)。此外，總酚提取物對DPPH·清除能力與其對ABTS+·清除能力呈極顯著正相關(guān)。

表376株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量及總酚提取物抗氧化能力10個指標間的相關(guān)性分析結(jié)果1)

Table3Resultofcorrelationanalysisontenindexesofphenolicscontentandantioxidantabilityoftotalphenolicextractsfromkernelof76individualsofCaryaillinoinensis(Wangenh.)K.Koch1)

指標Index各指標間的相關(guān)系數(shù) Correlation coefficient among each indexC1C2C3C4C5C6C7C8SA1SA2C11.000C20.877**1.000C30.909**0.803**1.000C40.661**0.621**0.630**1.000C50.233*0.1880.314**0.390**1.000C60.627**0.531**0.640**0.556**0.336**1.000C7-0.309-0.331-0.268-0.0290.165-0.0871.000C80.506**0.308**0.599**0.597**0.452**0.631**0.0721.000SA10.350**0.512**0.415**0.630**0.419**0.309**0.0310.312**1.000SA20.448**0.480**0.467**0.396**0.246*0.469**0.0380.357**0.577**1.000

1)C1： 總黃酮含量 Content of total flavonoids； C2： 縮合單寧含量 Content of condensed tannins； C3： 總酚含量 Content of total phenolics； C4： 沒食子酸含量Content of gallic acid； C5： 兒茶素含量Content of (+)-catechin； C6： 表兒茶素含量Content of (-)-epicatechin； C7： 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量Content of (-)-epigallocatechin gallate； C8： 鞣花酸含量Content of ellagic acid； SA1： DPPH·清除能力Scavenging ability to DPPH·； SA2： ABTS+·清除能力Scavenging ability to ABTS+·. *：P<0.05； ** ：P<0.01.

2.3.2 果實性狀與種仁生化性狀間的相關(guān)性分析

結(jié)合前期工作[14]的部分數(shù)據(jù)，對供試76株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量和總酚提取物抗氧化能力的10個指標與果實的8個性狀指標(包括果實的堅果質(zhì)量、種仁鮮質(zhì)量、堅果殼厚度、堅果縱徑、堅果橫徑、堅果果形指數(shù)、出仁率和含油率)進行相關(guān)性分析。結(jié)果見表4。

由表4可見：供試76株單株種仁的8個酚類成分含量指標與果實的8個性狀指標總體上均無顯著相關(guān)性，僅總黃酮含量和總酚含量與含油率呈極顯著負相關(guān)；兒茶素含量和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量與堅果殼厚度呈顯著正相關(guān)；表兒茶素含量與出仁率呈顯著正相關(guān)。而總酚提取物的抗氧化能力2個指標中，僅總酚提取物對DPPH·清除能力與含油率呈顯著正相關(guān)。

表476株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量及總酚提取物抗氧化能力10個指標與果實的8個性狀指標間的相關(guān)性分析結(jié)果1)

Table4Resultofcorrelationanalysisontenindexesofphenolicscontentandantioxidantabilityoftotalphenolicextractsfromkernelwitheighttraitindexesoffruitof76individualsofCaryaillinoinensis(Wangenh.)K.Koch1)

1)C1： 總黃酮含量 Content of total flavonoids； C2： 縮合單寧含量 Content of condensed tannins； C3： 總酚含量 Content of total phenolics； C4： 沒食子酸含量Content of gallic acid； C5： 兒茶素含量Content of (+)-catechin； C6： 表兒茶素含量Content of (-)-epicatechin； C7： 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量Content of (-)-epigallocatechin gallate； C8： 鞣花酸含量Content of ellagic acid； SA1： DPPH·清除能力Scavenging ability to DPPH·； SA2： ABTS+·清除能力Scavenging ability to ABTS+·. W1： 堅果質(zhì)量 Nut weight； W2： 種仁鮮質(zhì)量Fresh weight of kernel； TS： 堅果殼厚度 Shell thickness； D1： 堅果縱徑 Nut vertical diameter； D2： 堅果橫徑 Nut horizontal diameter； INS： 堅果果形指數(shù) Nut shape index； R1： 出仁率 Kernel rate； R2： 含油率 Oil content. *：P<0.05； ** ：P<0.01.

3 討論和結(jié)論

上述測定結(jié)果表明：76株薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量差異明顯，總黃酮、縮合單寧和總酚含量的變異系數(shù)分別為34.22%、40.11%和31.75%；5種酚類化合物含量的變異系數(shù)均在48%以上，其中，不同單株間表兒茶素含量的變異系數(shù)達到90.26%。說明不同薄殼山核桃單株種仁中酚類成分含量存在較大差異，這種差異既與不同單株的生長環(huán)境和生長狀況的差異有關(guān)，也與各單株的遺傳特性和次生代謝途徑的差異有關(guān)，是薄殼山核桃高酚類含量品種選育的基礎(chǔ)。

薄殼山核桃種仁中酚類成分含量豐富。Sarkis等[19]的比較結(jié)果顯示：薄殼山核桃種仁中的酚類成分含量顯著高于榛子(CorylusheterophyllaFisch.)和向日葵(HelianthusannuusLinn.)等其他油料作物。本研究結(jié)果顯示：薄殼山核桃種仁中不僅縮合單寧含量的平均值較高(18.65 mg·g-1)，其總酚含量的平均值也達到11.73 mg·g-1，明顯高于常見食用堅果腰果(AnacardiumoccidentaleLinn.)、松子〔部分松屬(PinusLinn.)植物的種子〕和開心果〔阿月渾子(PistaciaveraLinn.)〕的總酚含量(分別為1.37、0.32和8.67 mg·g-1)[20]。形成這一現(xiàn)象的原因一方面與植物本身的遺傳特性、次生代謝途徑以及生長狀況或生長環(huán)境的差異有關(guān)，另一方面與總酚含量測定過程中所用標準品以及總酚提取方法的差異有關(guān)。通常植物中總酚含量測定所用的標準品有綠原酸[8]、鞣花酸[6]和沒食子酸[21-22]等，但由于薄殼山核桃種仁中含量最高的酚類成分是鞣花酸[17]，因而本研究選用鞣花酸作為總酚測定的標準品。De La Rosa等[17]的研究結(jié)果顯示：經(jīng)過酸解的薄殼山核桃提取液中鞣花酸和沒食子酸的含量較高，而未經(jīng)過酸解的提取液中兒茶素和表兒茶素的含量較高；Villarreal-Lozoya等[8]用NaOH和HCl溶液對薄殼山核桃總酚提取液進行堿解和酸解，則總酚提取液中鞣花酸含量最高(2.50～4.73 mg·g-1)，沒食子酸含量次之(0.65～1.30 mg·g-1)，兒茶素和表兒茶素含量很低；而在本研究中，沒有對總酚提取液進行堿解或酸解，則總酚提取液中兒茶素含量最高。形成這一差異的原因為薄殼山核桃種仁中含量較多的縮合單寧類聚合物在堿性或酸性條件下可被分解成沒食子酸和鞣花酸，因此，未被堿解或酸解的薄殼山核桃種仁的總酚提取液中兒茶素含量較高，而堿解或酸解之后鞣花酸和沒食子酸含量較高。

Wu等[9]研究結(jié)果表明：在薄殼山核桃、松子、開心果、腰果和榛子等9種常見的食用堅果中，薄殼山核桃的抗氧化能力最強(179.40 μmol·g-1)，其總酚含量也最高(20.16 mg·g-1)。Villarreal-Lozoya等[8]認為，薄殼山核桃種仁的抗氧化能力與酚類成分的含量密切相關(guān)，特別是縮合單寧含量。本研究中，除表沒食子兒茶素沒食子酸酯外，76株薄殼山核桃單株種仁中多數(shù)酚類成分含量與總酚提取物的抗氧化能力具有極顯著相關(guān)性，而果實性狀指標與總酚提取物的抗氧化能力總體上無顯著相關(guān)性，可見薄殼山核桃種仁所含的酚類成分均具有較明顯的抗氧化能力；其中，縮合單寧含量與總酚提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力的相關(guān)系數(shù)均較大，分別為0.512和0.480，而5種酚類化合物與總酚提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力的相關(guān)系數(shù)均相對較小，可見不同酚類成分的抗氧化能力有一定差異?？s合單寧可能是薄殼山核桃種仁中主要的抗氧化成分，應進一步加強對薄殼山核桃種仁中縮合單寧類成分的研究。

李永榮等[23]認為，選育薄殼山核桃優(yōu)良品種的關(guān)鍵是重視出現(xiàn)在不同性狀中的極端值。在供試76株薄殼山核桃單株中，除表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量外，70號單株種仁的其他9個指標均排名前3，其中5個指標排名第1，其總酚提取物對DPPH·清除能力(618.04 μmol·g-1)顯著高于其他單株，且其種仁中總黃酮、縮合單寧和總酚含量也最高，表明70號單株可作為高酚類含量和高抗氧化能力的雙優(yōu)單株。除70號單株外，30號和29號單株也有6個酚類成分含量指標排名前6，可作為以高酚類含量為篩選目標的優(yōu)選單株；62號、69號和34號單株的2個抗氧化能力指標均排名前10，可作為以高抗氧化能力為篩選目標的優(yōu)選單株。

綜上所述，不同單株種仁中酚類成分的含量及總酚提取物的抗氧化能力均存在明顯差異，這為定向選育高酚類含量和高抗氧化能力的薄殼山核桃優(yōu)良品種提供了種質(zhì)資源。