月之湯方對(duì)小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

1.廣禾堂草本生物科技(上海)有限公司，上海 200030；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

哺乳期婦女分娩過(guò)程中大量消耗體力，產(chǎn)后身體虛弱，免疫力較低，易感染疾病[1]。中國(guó)現(xiàn)存最早的婦產(chǎn)科專著《婦人良方大全·產(chǎn)后門》中提到，產(chǎn)婦產(chǎn)后不注重調(diào)理，則“小可虛羸，失于將補(bǔ)，便成大患，終身悔而不及”，“經(jīng)云婦人非止臨產(chǎn)須憂，產(chǎn)后大須將理，慎不得恃身體和平取次為之。乃縱心恣意，無(wú)所不為。若有觸傷，便難整理。犯時(shí)微若秋毫，感病重如山岳，知命者可不謹(jǐn)之！”[2]。同時(shí)，產(chǎn)婦身體機(jī)能與乳汁的分泌量、嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育都具有密切關(guān)系，需要重視[3]。因此，乳母應(yīng)提高哺乳期間免疫功能，預(yù)防疾病的發(fā)生，確保母嬰健康。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，中藥多糖、皂苷類等成分具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，從根本上提高乳母的抗病能力[4]。月之湯方所含桔梗、山藥、芡實(shí)、黃精、薏苡仁等中藥，可增強(qiáng)產(chǎn)后婦女免疫活性，調(diào)節(jié)產(chǎn)后婦女免疫功能[5]。為觀察月之湯方對(duì)小鼠免疫功能的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠免疫缺陷模型，測(cè)定小鼠血液白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)、小鼠細(xì)胞免疫功能及體液免疫功能、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，為其增強(qiáng)哺乳期婦女免疫功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及試劑 月之湯方(廣禾堂草本生物科技(上海)有限公司，批號(hào)20170326)，生脈膠囊(正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)20161201)，氫化可的松注射液(安陽(yáng)九州藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)140820001A)。

1.2 動(dòng)物 昆明種SPF級(jí)小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重18～22g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK( 粵) 2011-0015。

1.3 儀器 XE-2100型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司)，PS-2013秒表(深圳市追日電子科技有限公司)，ME204E102型萬(wàn)分之一天平電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品液配制 受試樣品配制：月之湯方加熱水溶解，配制成0.5、1、1.5 g·mL-1的混懸液。對(duì)照組藥物樣品配制：取生脈膠囊9粒(0.06 g·mL-1) ，用研缽研碎呈粉末后加水至50 mL，臨用前現(xiàn)配。

2.2 對(duì)小鼠血液白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)的影響[6]取昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、月之湯方低劑量組( 5.2 g·kg-1)、中劑量組(10.4 g·kg-1)、高劑量組( 15.6 g·kg-1)、陽(yáng)性藥物組(0.6 g·kg-1)，每組10只，按10 mL·kg-1灌胃給藥，空白及模型組給予等體積蒸餾水。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃給予受試物30天，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食。于第3周后，建立小鼠免疫缺陷模型，各組動(dòng)物肌肉注射免疫抑制劑氫化可的松40 mg·kg-1，共5次，間隔24 h，在末次注射給藥后次日測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)分析。

實(shí)驗(yàn)第31天利用摘除小鼠眼球的方法采集全血。采用無(wú)菌潔凈的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè)或雙側(cè)眼球，使血液自由滴入裝有抗凝劑的1.5 mL離心管中。采血過(guò)程中將血液與抗凝劑不斷搖勻，防止血液凝固，每只動(dòng)物采集抗凝全血約1 mL。上機(jī)前將血液顛倒混勻，過(guò)程中注意檢查其是否存在凝塊，并于24 h內(nèi)應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)小鼠血液樣品中白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[7]分組、給藥及造模同2.2，實(shí)驗(yàn)第25天，使用脫毛劑除去小鼠右側(cè)背中部的毛發(fā)。實(shí)驗(yàn)第26天，使用微量加樣器于小鼠脫毛部位滴涂5% 2,4-二硝基氟苯溶液(DNFB)20μL致敏。實(shí)驗(yàn)第30天，小鼠左耳殼(兩面)滴涂1%DNFB溶液20μL作為攻擊；小鼠右耳滴涂丙酮、麻油混合液20 μL作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)第31天(即攻擊后24 h)，稱取各小鼠體重并頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，立即稱重。以(左耳片重量-右耳片重量)為耳廓腫脹度表示遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的強(qiáng)度。同時(shí)，取小鼠胸腺、脾臟稱重，以小鼠脾臟、胸腺濕重(mg)各作為脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。計(jì)算公式見(jiàn)公式1。

公式1

2.4 對(duì)小鼠體液免疫功能的影響[8]分組、給藥及造模同2.2。實(shí)驗(yàn)第26天，每只鼠腹腔注射壓積為2%(V/V)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0.2 mL進(jìn)行免疫。間隔4天后，摘除小鼠眼球并取血于離心管內(nèi)，放置約1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000 r·min-1離心10 min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100 μL，再加入0.5%(V/V)的SRBC懸液100 μL，混勻，裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3 h，觀察各組小鼠血球凝集程度。

其中，血清凝集程度一般分為5級(jí)(0-Ⅳ)記錄，按公式2計(jì)算抗體積數(shù)。若受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對(duì)照組的抗體積數(shù)，則可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

抗體積數(shù)=(S1+2S2+3S3……nSn)

公式2

式中1、2、3……n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級(jí)別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。

0級(jí)紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰。

Ⅰ級(jí)紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成園點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞。

Ⅱ級(jí)凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見(jiàn)到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)。

Ⅲ級(jí)凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,中心隱約可見(jiàn)一個(gè)小紅點(diǎn)。

Ⅳ級(jí)凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。

2.5 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響[9]分組、給藥及造模同2.2。實(shí)驗(yàn)第28天，小鼠腹腔注射6%淀粉液1 mL，連續(xù)注射3日。3日后，小鼠腹腔注射1%的雞紅細(xì)胞懸液2 mL，輕揉腹部使雞細(xì)胞分散。25～30 min椎脫臼法處死小鼠并對(duì)小鼠腹腔注射生理鹽水2 mL。在干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，同時(shí)向其中滴加一滴小鼠腹腔液。靜置10 min，腹腔巨噬細(xì)胞貼壁后，棄去生理鹽水，并對(duì)稍干后的標(biāo)本滴加3～4滴瑞氏染液進(jìn)行染色，以完全蓋住標(biāo)本為宜。5 min后甩去標(biāo)本玻片上多余染液，自來(lái)水輕洗，吸水紙吸干，干燥后油鏡鏡檢。按公式3和公式4分別計(jì)算吞噬百分率及吞噬指數(shù)，進(jìn)行組間比較。

公式3

公式4

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠血液白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)的影響 月之湯方5.2、10.4、15.6 g·kg-1劑量組的白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 月之湯方對(duì)小鼠白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.2 對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響 月之湯方5.2 g·kg-1劑量組耳廓腫脹度、脾臟指數(shù)顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 月之湯方對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3.3 對(duì)小鼠體液免疫功能的影響 月之湯方5.2、10.4 g·kg-1劑量組的抗體積數(shù)分別為27.77±9.55、30.55±7.88，均顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響 月之湯方5.2、10.4、15.6 g·kg-1劑量組的吞噬百分率顯著高于模型組，月之湯方5.2 g·kg-1劑量組的吞噬指數(shù)顯著高于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4、圖1。

表3 月之湯方對(duì)小鼠體液免疫功能的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

表4 月之湯方對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

4 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為產(chǎn)后婦女具有氣血虧損，臟腑虛弱，瘀血阻滯，心氣不足，易感風(fēng)寒的生理特點(diǎn)[10]。產(chǎn)婦作為特殊人群，在增強(qiáng)其免疫功能方面應(yīng)給予充分重視。

月之湯方源自生化湯裁剪變化而成[10]，生化湯被譽(yù)為“血塊圣藥”，是治療產(chǎn)后諸癥的重要代表方劑。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為產(chǎn)后用藥原則應(yīng)以補(bǔ)氣養(yǎng)血、調(diào)和脾胃為主，月之湯方含有桔梗、山藥、芡實(shí)等多種中藥，其所含有的天然多糖、皂苷類等成分已被證明具有抗腫瘤和免疫增強(qiáng)的作用，而其他成分往往起協(xié)同或輔助增強(qiáng)免疫作用[11]。

白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)可衡量機(jī)體接受免疫抑制劑后的免疫應(yīng)答功能，脾臟和胸腺的相對(duì)重量、吞噬百分率及吞噬指數(shù)均是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示月之湯方為免疫增強(qiáng)劑，能夠明顯增加小鼠血液白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)，提高小鼠細(xì)胞免疫與體液免疫功能，可不同程度提高抗體活性。

綜上所述，月之湯方能夠調(diào)節(jié)人體免疫機(jī)能，增加人體免疫力，為其開(kāi)發(fā)成增強(qiáng)免疫類保健食品提供理論依據(jù)。