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    乳腺癌組織中miR-214和FOXM1的表達(dá)變化及意義

    2018-11-22 07:59:46李艷麗胡曉麗韓華王義舫付紅霞
    山東醫(yī)藥 2018年41期
    關(guān)鍵詞:癌基因細(xì)胞系引物

    李艷麗,胡曉麗,韓華,王義舫,付紅霞

    (1中國人民解放軍第二六〇醫(yī)院,石家莊050041;2河北省人民醫(yī)院)

    乳腺癌為女性常見的惡性腫瘤之一,是發(fā)達(dá)國家女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。雖然近年來乳腺癌的預(yù)后有所改善,患者5年生存率超過80%,但在手術(shù)治療和全身輔助治療后仍有約30%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。微小RNA-214(miR-214)是微小核糖核酸(miRNA)家族成員之一,該基因位于人類染色體1q24.3區(qū)域DNM3 的14 號內(nèi)含子上。miR-214已被證實在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高或降低,作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展[3]。但目前有關(guān)miR-214在乳腺癌中表達(dá)的研究甚少,且結(jié)果不一[4,5]。叉頭盒蛋白質(zhì)M1(FOXM1)屬于Forkhead轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一,研究已證實其在多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)增高,作為促癌基因參與腫瘤進(jìn)程。近期在對miR-214靶基因的研究中發(fā)現(xiàn),miR-214可通過調(diào)控FOXM1進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[6]。2018年1~3月,我們檢測了miR-214、FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá),分析其相關(guān)性及與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系,為進(jìn)一步研究miR-214和FOXM1在乳腺癌治療中的作用提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 收集2015年1月~2017年1月中國人民解放軍第二六〇醫(yī)院手術(shù)切除的110例乳腺組織新鮮標(biāo)本,同時收集相應(yīng)的癌旁組織新鮮標(biāo)本(距離原發(fā)病灶邊緣至少5 cm)作為對照,組織標(biāo)本在離體后生理鹽水清洗,迅速置入液氮中,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。納入標(biāo)準(zhǔn):①女性患者;②經(jīng)術(shù)后病理檢查明確為原發(fā)性乳腺癌;③有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前接受過放化療、生物免疫治療等任何抗腫瘤治療;②合并有其他器官的惡性腫瘤。110例乳腺癌患者中,≥55歲 72例,<55歲38例;絕經(jīng)82例,未絕經(jīng)28例;腫瘤最大直徑≤2 cm 29例,>2 cm 81例;組織學(xué)分級Ⅰ級25例,Ⅱ+Ⅲ級85例;TNM分期Ⅰ+Ⅱ期80例,Ⅲ+Ⅳ期30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均知情同意。

    1.2 乳腺癌及癌旁組織中miR-214、FOXM1 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。按照miRNA提取試劑盒或RNA提取試劑盒(北京天根生化公司)說明書提取組織中miRNA或總RNA,分光光度計檢測提取的miRNA或總RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,采用miR-214或FOXM1特異性逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。以cDNA為模板,按照qRT-PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min;40 個循環(huán)(95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s)。miR-214正向引物:5′-GCACAGCAGGCACAGAC-3′,反向引物:5′-GCACAGCAGGCACAGAC-3′。U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反向引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。FOXM1正向引物:5′-AAGGTTGAGGAGCCTTCGAG-3′,反向引物:5′-ATTCGGTCGTTTCTGCTGCTT-3′。GAPDH正向引物:5′-CGGATTTGGTCGTATTGG-3′,反向引物:5′-TCCTG GAAGATGGTGATG-3′。miR-214以U6作為內(nèi)參基因,F(xiàn)OXM1以GAPDH作為內(nèi)參基因,相對表達(dá)采用2-△△Ct法計算。

    1.3 乳腺癌及癌旁組織中FOXM1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。提取組織中總蛋白,BCA法定量蛋白質(zhì)濃度。取30 μg/孔 樣品上樣,10% SDS-PAGE電泳分離(60 V 30 min,120 V 50 min),濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜(250 mA 90 min),TBST洗膜3次,室溫下5 %脫脂奶粉封閉2 h后,分別加入一抗人FOXM1(體積稀釋比例1∶1 000)、GAPDH(體積稀釋比例1∶8 000)抗體,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(體積稀釋比例1∶2 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,ECL顯影液顯影,采集圖片,Quantity One軟件分析條帶灰度。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-214 mRNA在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)比較 乳腺癌組織和癌旁組織中miR-214 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.40±0.11、1.02±0.06。乳腺癌組織miR-214 mRNA的表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05)。

    2.2 FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)比較 乳腺癌和癌旁組織中FOXM1 mRNA的相對表達(dá)量分別為4.01±0.45、1.01±0.04,乳腺癌組織中FOXM1 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)。乳腺癌和癌旁組織中FOXM1蛋白相對表達(dá)量分別為0.92±0.23、0.24±0.11,乳腺癌組織中FOXM1蛋白表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)。

    2.3 乳腺癌組織中miR-214與FOXM1 mRNA的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示,乳腺癌組織中miR-214和FOXM1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.729,P<0.05)。

    2.4 miR-214表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中miR-214表達(dá)與患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05),而與年齡、絕經(jīng)、腫瘤最大直徑、組織學(xué)分級及ER、PR、HER-2無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

    表1 miR-214表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系±s)

    2.5 FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)與患者腫瘤組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05),而與年齡、絕經(jīng)、腫瘤最大直徑及ER、PR、HER-2均無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

    3 討論

    乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜生物學(xué)過程,多種癌基因的異常表達(dá),多種抑癌基因的失活,DNA錯配修復(fù)功能的缺失,導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。miRNA是一類內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA,研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為癌基因或抑癌基因在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常,影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,已成為目前腫瘤研究及基因治療的熱點問題。miR-214是近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要成員之一,目前研究顯示miR-214在諸多惡性腫瘤中表達(dá)異常,扮演癌基因或抑癌基因的角色,參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-214在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低,且與膠質(zhì)瘤的病理分級呈負(fù)相關(guān),起抑癌基因的作用。Penna等[8]在研究中報道m(xù)iR-214 在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系及黑色素瘤組織中表達(dá)異常增高,可能起癌基因作用。Derfoul等[9]發(fā)現(xiàn)miR-214在人非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中表達(dá)明顯降低,且轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系比非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系中miR-214 水平更低。本研究發(fā)現(xiàn),miR-214在乳腺癌組織中表達(dá)較相應(yīng)癌旁組織低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示miR-214在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起抑癌基因作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-214表達(dá)與患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Ⅲ~Ⅳ期組織中miR-214水平低于Ⅰ~Ⅱ期,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中miR-214水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示miR-214異常表達(dá)減低與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

    表2 FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系±s)

    FOXM1是Forkhead蛋白家族中的重要成員,基因定位于12p13.3,含有110個氨基酸,在調(diào)控細(xì)胞周期、紡錘體裝配、染色體分離等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在胃癌[10]、胰腺癌[11]、食管鱗癌[12]等多種實體腫瘤中表達(dá)異常增高,且與患者的不良預(yù)后有關(guān)。FOXM1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,參與PI3K/AKT、Raf/ MEK/MAPK、Akt/Snail等多個重要信號途徑,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。本研究中我們發(fā)現(xiàn),F(xiàn)OXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)均較相應(yīng)癌旁組織升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示FOXM1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起癌基因作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中FOXM1 mRNA表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Ⅲ~Ⅳ期組織中FOXM1 mRNA水平高于Ⅰ~Ⅱ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中FOXM1 mRNA水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中,Ⅱ~Ⅲ級組織中FOXM1 mRNA水平高于Ⅰ級,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,提示FOXM1異常表達(dá)增高與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

    某個特定的miRNA可調(diào)控多個靶基因,而某個特定的靶基因可受多個miRNA調(diào)控。目前已證實有諸多miRNA與靶基因共同作用參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[14]。近期Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn),miR-214能通過靶向調(diào)控FOXM1基因表達(dá),影響宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和對化療藥物的敏感性,提示miR-214能調(diào)控FOXM1表達(dá)共同參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示,乳腺癌組織中miR-214和FOXM1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示miR-214與FOXM1可能在乳腺癌中亦存在靶向調(diào)控關(guān)系,共同作用參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

    綜述所述,乳腺癌組織中miR-214表達(dá)異常降低,F(xiàn)OXM1表達(dá)異常增高;二者共同作用參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

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