HTR4介導Hippo信號通路在糖尿病心肌病性心力衰竭中的作用及莫沙比利干預效果研究

張治平 倪松 林筍美

糖尿病是由胰島素分泌不足或功能異常而導致的一組以持續(xù)性高血糖為病理特征的代謝性疾病，常累及心血管系統(tǒng)，誘發(fā)糖尿病性心肌病，是獨立于心臟自主神經(jīng)病變之外的心臟結構和功能異常［1］。少數(shù)患者可能發(fā)生糖尿病心肌病性心力衰竭（DCM-HF），發(fā)病程度重，病死率高［2］。尋找兼有改善心肌功能和降血糖效果的藥物是降低DCM-HF發(fā)生率，改善DCMHF治療效果的重要方向，在此導向下，5-羥色胺受體4（HTR4）受到越來越多的重視［3］。作為HTR4激動劑，莫沙比利可能同時具有心肌保護和降糖功能，2016年1月至12月作者通過實驗研究，建立DCM-HF大鼠模型，觀察莫沙比利作用的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物為100只SPF級雄性SD大鼠，7～8個月齡，體重（180±20）g，購自浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 實驗藥品 枸櫞酸莫沙比利片，生產(chǎn)企業(yè)：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：H19990315。

1.3 主要儀器與試劑 生物顯微鏡（日本Olympus，CX23）；小 動 物 超 聲 儀（ 加 拿 大 Visual Sonics，VEVO）；智能型高效離心機（德國Beckman Coulter，Avanti JXN-30/26）；血糖儀（瑞士ROCHE，ACCUCHEK）；小型垂直電泳和電轉(zhuǎn)印裝置（美國BIORAD，Mini- PROTEAN3）；鏈脲佐菌素（Sigma官網(wǎng)，S0130）；DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，DA1010）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，P0009）；多克隆兔抗HTR4抗體（ab60359）、多克隆兔抗LATS2抗體（ab110780）、單克隆兔抗YAP1抗體（ab52771）、山羊抗兔IgG抗體（ab150077）均購自Abcam官網(wǎng)。

1.4 模型制備與評價方法 模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組均采用高脂飲食和腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備DCM-HF模型，主要步驟：予以高脂飲食，配方：50%普通飼料+28%豬油+2%蛋黃+20%糖，飼養(yǎng)期間每隔4周尾靜脈取血測定糖耐量和胰島素耐量，產(chǎn)生胰島素抵抗者予以鏈脲佐菌素，多數(shù)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗時間為8～12周。腹腔注射鏈脲佐菌素，用量35mg/kg，注射后繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)，每隔1周尾靜脈取血測定血糖，連續(xù)2次測定值≥11.1mmol/L為糖尿病模型制備成功。所有成功的糖尿病模型繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)8周，高劑量組、中劑量組和低劑量組分別予以莫沙比利4mg/kg、2mg/kg、1mg/mg，溶于無菌蒸餾水，灌胃給藥。8周后采用超聲心動圖測定大鼠心功能，主要指標：左室舒張末期容積（LVEDV）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）。左室射血分數(shù)（LVEF）=（LVEDV- LVESV）/LVEDV×100%；左 室 縮 短 分 數(shù)（LVFS）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%。LVEF和LVFS均較正常值下降＞30%為DCM-HF模型成功。

1.5 心肌組織病理觀察方法 各組隨機選取6只，進行多聚甲醛心臟灌注，灌注的目的在于排出循環(huán)系統(tǒng)血液，并固定心臟組織，灌注至全身僵硬時，可取完整心臟組織，制備石蠟病理切片，厚度3～5μm。二甲苯脫蠟，連續(xù)2次，梯度酒精脫水，45%、60%、75%、85%、95%、無水乙醇分別浸泡5min。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅復染，再次經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，生物顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)。

1.6 心肌組織蛋白表達水平測定方法 各組剩余大鼠不行心臟灌注，直接斷頭處死，取心肌病理組織，液氮保存，用于免疫蛋白印記（WB）實驗。主要步驟：采用蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取心肌組織的蛋白質(zhì)，并溶解于Buffer液，備用。BCA法測定樣品蛋白質(zhì)濃度，以10μg/電泳通道的上樣量進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將不同分子量的蛋白條帶分開，并常規(guī)電轉(zhuǎn)印至NC膜。5%的脫脂牛奶封閉1h，封閉的作用在于消除非特異性蛋白結合條帶對實驗結果的影響。一抗孵育，HTR4、LATS2、YAP1抗體濃度分別為1∶1500、1∶2000和1∶1500，4℃過夜；二抗孵育，三種蛋白的二抗一致，濃度均為1∶2000，37℃孵育90min。ECL顯影和暗室顯像后保留膠片，Image J軟件分析灰度值，目的產(chǎn)物蛋白表達量=目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布計量資料以（）表示，三組間比較用方差分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型制備結果 本實驗無大鼠死亡，模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組模型制備成功率分別為60%（12只）、75%（15只）、65%（13只）、65%（13只），整體成模率為66.3%。

2.2 各組大鼠心肌功能比較 見表1。

表1 各組大鼠心肌功能比較［%，（）］

表1 各組大鼠心肌功能比較［%，（）］

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，ΔP＜0.05；與中劑量比較，▲P＜0.05

組別 n LVEF LVFS模型組 12 65.5±7.3* 37.8±5.1 *低劑量組 15 72.4±8.2 *# 44.3±5.5 *#中劑量組 13 79.3±9.2 *#Δ 51.7±6.4 *#Δ高劑量組 13 84.6±9.4 *#Δ▲ 57.2±7.2 *#Δ▲對照組 20 94.3±10.6 71.3±9.1

2.3 各組大鼠心肌組織病理觀察 對照組大鼠心肌細胞排列整齊，連接緊密，有明顯的肌纖維結構，肌束間分割線明顯；模型組細胞核出現(xiàn)溶解，肌絲、肌節(jié)、肌纖維結構消失，胞漿內(nèi)可見較大的增厚性條帶；低劑量組、中劑量組和高劑量組的變化介于對照組和模型組之間，病變程度較模型組輕。見圖1。

圖1 各組大鼠典型心肌組織HE染色

2.4 各組大鼠心肌組織HTR4、LATS2、YAP1表達水平比較 見表2、圖2。

表2 各組大鼠心肌組織HTR4、LATS2、YAP1表達水平比較

圖2 各組大鼠心肌組織HTR4、LATS2、YAP1的WB實驗灰度圖

3 討論

HTR4激動劑莫沙比利能提高II型糖尿病患者的血胰島素水平和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平，具有降糖作用，被認為是一種潛在的抗II型糖尿病藥物。另有研究表明［4］，激活HTR4能夠增加胰島素受體酪氨酸殘基磷酸化，提高胰島素受體的敏感性，緩解糖尿病性胃輕癱。進一步研究表明［5］，HTR4特異性的分布于肌肉組織，因此高表達于心肌組織、胃腸肌群和骨骼肌。HTR4在心力衰竭的治療中仍受爭議，其拮抗劑和激動劑均可能有治療心力衰竭的作用。一方面，早期的研究表明5-羥色胺（5-HT）與受體HTR4結合可發(fā)揮正性肌力作用，促進心肌的收縮功能；實驗動物性研究也證實心肌中HTR4水平在發(fā)生充血性心力衰竭時可提高數(shù)倍，同時與心肌收縮性呈正比，提示HTR4在心力衰竭心肌中的表達可能是一種保護性機制［6］。另一方面，有研究指出HTR4拮抗劑能顯著提高心臟左室舒張功能，改善左室射血分數(shù)，但對其他指標卻無改善［7］。產(chǎn)生這些爭議的原因可能與疾病類型和藥物使用時間有關，DCM-HF的病理結構不同于充血性心力衰竭，HTR4在DCM-HF中具體發(fā)揮什么作用還需要相加詳實的數(shù)據(jù)支持。有學者利用基因芯片技術證實在糖尿病心肌病心肌組織HTR4水平表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，伴隨著心臟出現(xiàn)收縮功能下降，進而收縮和舒張功能均下降。以上研究提示HTR4及其激動劑可能兼有降血糖作用和改善心力衰竭作用。

Hippo信號通路是一條細胞生長抑制性信號通路，能夠控制器官的生長、發(fā)育和損傷后修復，對心肌發(fā)育與修復、心血管發(fā)育與修復均有重要作用［8］。在Hippo信號通路中，LATS是最主要的核心激酶之一，高表達于心肌和骨骼肌組織，其定位與HTR4基本一致。進一步研究表明控制Hippo通路的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）能被HTR4激活，表明Hippo通路可能參與HTR4對心血管和骨骼肌系統(tǒng)的功能調(diào)控［9］。

本資料結果顯示，DCM-HF大鼠的心肌功能明顯低于健康大鼠，經(jīng)莫沙比利干預后其心肌功能有明顯提高，且提高程度與干預劑量有一定的相關性。同時DCM-HF大鼠的HTR4和LATS2表達水平明顯降低，YAP1表達水平升高，經(jīng)莫沙比利干預后HTR4和LATS2表達水平得以升高，YAP1表達水平得以降低，且其改變幅度與劑量密切相關。LATS2是Hippo通路的核心成員，過表達LATS2的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟發(fā)育受到阻礙，出現(xiàn)體積減小、重量減輕或功能不全［10］；敲除LATS2的小鼠由于中胚層過度增殖，也會出現(xiàn)心臟發(fā)育異常，過度增厚，心室結構不良［11］。YAP1是Hippo通路的主要下游效應蛋白，LATS2能夠磷酸化YAP1的127位點，使其無法進入細胞核傳遞信號，停留在細胞質(zhì)而失活，因此Hippo通路主要通過抑制YAP1活性而調(diào)控其下游生理功能，通過該途徑，Hippo通路對Wnt、胰島素樣生長因子（IGF）信號等均可達到調(diào)控作用［12］。敲除YAP1與過表達LATS2可發(fā)揮相仿的作用，表現(xiàn)為小鼠胚胎發(fā)育障礙，器官發(fā)育不全而死亡。在小鼠出生以后誘導心肌細胞過表達YAP1還可以增加心肌細胞數(shù)量和心臟總重量?？梢?，Hippo通路對心臟有雙重作用，激活Hippo通路對心臟修復是否有利取決于疾病的具體病理變化。本研究結果顯示HTR4激動劑莫沙比利對DCM-HF大鼠的心肌功能具有改善作用，且該作用與激活Hippo通路有關。