嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎兒童胃黏膜血管活性腸肽及其受體表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及總IgE水平變化的關(guān)系

錢淑怡，楊 輝，金 玉，劉志峰，朱 航，吳潤秋，練 敏

嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎(eosinophilic gastroenteritis，EG)是以胃腸道組織中嗜酸性粒細(xì)胞比例異常升高和浸潤為特征的胃腸道疾病，其中胃是EG常累及的器官之一[1]。目前，中國兒童EG的發(fā)病率逐漸升高，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為變態(tài)反應(yīng)、遺傳因素、免疫功能異常、營養(yǎng)因素以及藥物、食物等原因均參與EG發(fā)病[2-4]。EG可發(fā)生于任何年齡，其臨床表現(xiàn)多樣且無特異性[5]。血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)為分泌素/胰高血糖素超家族成員，由28個氨基酸殘基組成，是一種非膽堿能非腎上腺能神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布在胃腸黏膜[6]，除具有舒張血管的作用以外，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、平滑肌舒張等多種功能，對胃腸道的生理、生化、免疫功能有重要的調(diào)節(jié)作用。慢性特發(fā)性蕁麻疹中VIP可作用于血管活性腸肽2(vasoactive intestinal peptide type 2 receptor,VPAC2)而調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞(mast cells，MCs)的脫顆粒過程[7]。研究證實(shí)哮喘患者采用霧化吸入VIP法可減輕哮喘發(fā)作的嚴(yán)重程度，并可一定程度上減輕氣道平滑肌的增厚，從而抑制氣道重塑[8]。但VIP在EG中的作用目前鮮見報(bào)道。本研究擬測定兒童胃黏膜中VIP和VPAC2表達(dá)的變化，探討其與胃黏膜中和外周血嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)數(shù)量及總IgE水平的關(guān)系，研究VIP和VPAC2在兒童EG中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

采用前瞻性非隨機(jī)對照臨床研究方法，納入 2015年7月至2016年8月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化?？谱≡旱?0例EG患兒作為EG組，其中男16例，女4例，年齡0.44～13.58歲，平均(6.38±4.59)歲。EG納入標(biāo)準(zhǔn)參照Talley標(biāo)準(zhǔn)[9]，有反復(fù)腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等臨床表現(xiàn)的患兒入院后行外周血EOS測定并計(jì)數(shù)，并行總免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平測定以及胃鏡檢查。選取同期同一年齡段胃鏡下病理活檢未見異常且EOS<10個/高倍視野、外周血EOS計(jì)數(shù)及總IgE測定正常的兒童為對照組，同時需排除幽門螺桿菌感染、變應(yīng)性紫癜、寄生蟲感染、自身免疫性疾病、炎癥性腸病、結(jié)核、真菌感染、功能性胃腸病等。對照組受試者共20例，其中男15例，女5例，年齡1.08～12歲，平均(5.46 ±3.27)歲。EG組與對照組受試者年齡和性別的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.70，P=0.49；χ2=0.14，P=0.70)(表1)。本研究經(jīng)南京兒童醫(yī)院倫理委員會審批通過(批件號：201701015)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料的收集:詢問病史，記錄患兒的一般情況(姓名、性別、年齡等)、臨床表現(xiàn)、個人或家族成員變態(tài)反應(yīng)史(哮喘、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、食物及藥物變態(tài)反應(yīng)史)；行外周血EOS計(jì)數(shù)及總IgE水平測定；與患兒家長溝通，征得家長同意并簽署知情同意書后在全身麻醉下行胃鏡(OLYMPUS GIF-XQ 260，日本)檢查并留取胃竇黏膜組織，對照組兒童活檢部位為胃鏡下未見明顯異常的胃竇部或異常部位旁開5 cm正常胃竇處。取得的標(biāo)本組織行蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察胃黏膜中EOS的數(shù)量變化，測定胃黏膜中VIP及VPAC2含量。EOS數(shù)量在20～40個/HPF者為輕度升高，40～60個/HPF者為中度升高，>60個/HPF者為重度升高。

1.2.2 石蠟切片的制備:將獲得的胃腸黏膜組織標(biāo)本置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定、脫水，置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇4 h、85%乙醇2 h、90%乙醇2 h、95%乙醇1 h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ 10 min，然后再浸于60℃石蠟中1 h，石蠟包埋。制備4 μm厚切片，60 ℃烘箱內(nèi)烤片，待水烤干蠟烤化后取出常溫保存。

1.2.3 EOS的蘇木精-伊紅染色:石蠟切片脫蠟至水，依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脫蠟各20 min，按順序置于梯度乙醇溶液中各5 min，蒸餾水洗3 min。蘇木精染液中染核5～10 min，自來水沖洗約10 min。體積分?jǐn)?shù)1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，待切片變紅、顏色較淺時流水沖洗，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min，依次放入95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各5 min、無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各5 min及二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，稍晾干，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡200倍下任意計(jì)數(shù)10個視野內(nèi)胃腸黏膜EOS數(shù)量，取平均值，EG組要求EOS>20個/HPF，對照組要求<10個/HPF。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法測定組織標(biāo)本中VIP及VPAC2表達(dá):將切片置于烤箱60 ℃烤片30 min使蠟熔化，依次經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min,脫蠟。梯度乙醇脫水各5 min，蒸餾水水化3 min，PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5 min。組織切片置于枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min。濕化盒內(nèi)用免疫組化筆圈定切片上的組織，加1滴或50 μl內(nèi)源性過氧化物酶抑制劑，室溫下孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS溶液洗滌3次，每次5 min。滴加山羊非免疫血清，室溫封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，滴加用一抗稀釋液稀釋的兔抗人VIP多克隆抗體或兔抗人VPAC2多克隆抗體(美國Abcam公司)，切片平放于濕化盒內(nèi)室溫下孵育60 min或4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。稍甩干后滴加羊抗兔IgG(中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，室溫下孵育50 min。PBS溶液洗滌3次，每次5 min。滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染，3 min，自來水沖洗返藍(lán)。梯度乙醇各浸泡5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡20 min脫水透明，稍晾干，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡200倍下任意選取3個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖片進(jìn)行判斷，得出每張照片吸光度(A)值以及組織的像素面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

EG患兒臨床主要表現(xiàn)為腹痛者占80%(16/20)，其中上中部腹痛者占25%(4/16)，其余患者均為全腹痛，EG組患者與對照組受檢者腹痛、腹瀉、嘔吐、腹脹和排便困難的例數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.102、0.497、0.465、0.102、0.179)；兩組受檢者大便帶血和腹水例數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P<0.001)(表1)。

2.2 受檢者外周血EOS數(shù)目lgE水平的變化

EG患兒外周血EOS絕對值和外周血總Ig E水平較對照組受檢者均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.000)(表2)。EG組有哮喘、變應(yīng)性鼻炎或濕疹等病史者占35%(7/20)，父母有變態(tài)反應(yīng)史者占30%，分別高于對照組的15%(3/20)和5%(1/20)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。對照組受檢者外周血EOS% 為0.5%～5.0%、EOS#為0.05～0.5×109/L和總IgE水平為9.31～165.3 U/ml的例數(shù)均為0，EG組患者分別占75%(15/20)、75%(15/20)和60%(12/20)。

2.3 兩組受檢者胃鏡下組織變化例數(shù)的比較

EG組患者胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍例數(shù)和比例明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表3，圖1)。對照組未發(fā)現(xiàn)胃黏膜結(jié)節(jié)樣隆起或增生者，而EG組4例出現(xiàn)上述改變。

2.4 兩組受檢者胃竇黏膜中EOS數(shù)量的比較

蘇木精-伊紅染色顯示，EG組患者胃竇黏膜EOS數(shù)量增多(圖2)，其中EOS數(shù)量為20～40個/HPF者11例，40～60個/HPF者7例，>60個/HPF者2例，平均(42.89±19.47)個/HPF，明明顯多于對照組的(7.83±2.32)個/HPF，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組患兒不同臨床癥狀例數(shù)比較[n(%)]Table 1 Comprison of patients with different clinical symptoms between two groups[n(%)]

Fisher精確概率法; EG：嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎

表2 兩組受檢者外周血EOS計(jì)數(shù)和lgE水平比較[M(Q1，Q3)]Table 2 Comprison of peripneral EOS number and IgE level between two groups[M(Q1，Q3)]

Mann-Whitney U檢驗(yàn); EG：嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎；EOS: 嗜酸性粒細(xì)胞;EOS%參考范圍：0.5～5%；EOS#參考范圍：0.05～0.5×109/L；外周血總IgE水平參考范圍：1.31～165.3 U/ml

表3 兩組受檢者胃鏡下異常表現(xiàn)例數(shù)比較[n(%)]Table 3 The number comprison of abnormal findings in gastric mucosa between two groups[n(%)]

Fisher精確概率法； EG：嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎

圖 1 兩組受檢者胃鏡下胃黏膜表現(xiàn)Fig 1 Comparison of gastrointestinal mucosa findings in the patients between two groupsA：對照組患兒胃竇黏膜正常; B：EG組患兒胃竇黏膜充血伴散在出血點(diǎn)

2.5 兩組受檢者胃竇黏膜組織中VIP及VPAC2表達(dá)變化

胃竇黏膜組織中VIP及VPAC2陽性表達(dá)為棕褐色染色。對照組受檢者胃竇黏膜組織中VIP陽性表達(dá)A值為0.059±0.023，EG組患者胃竇黏膜組織中VIP陽性表達(dá)A值為0.012±0.009，明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對照組受檢者胃竇黏膜組織中VPAC2陽性表達(dá)A值為0.075±0.018，明顯高于EG組患者的0.032±0.019，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3,4)。

圖2 胃竇黏膜組織EOS常規(guī)組織病理學(xué)檢查(HE ×200)

Fig3 Pathological manifestation of EOS cells in gastrointestinal mucosa(HE ×200)

A：對照組患兒胃竇可見少量EOS細(xì)胞; B：EG組患兒胃竇黏膜組織中EOS數(shù)量對照組患兒

圖3 胃竇黏膜VIP的表達(dá)(DAB ×200)

Fig3 Expression of VIP in gastrointestinal mucosa(DAB ×200)

A：對照組患兒胃竇黏膜中可見VIP陽性細(xì)胞多; B：EG組患兒胃竇黏膜中VIP陽性細(xì)胞少于對照組患兒; C：2個組間患兒胃竇黏膜組織中VIP陽性表達(dá)相對值比較,與對照組比較，*P<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))

圖4 兩組患兒胃竇黏膜中VPAC2表達(dá)(DAB ×200)

Fig4 Expression of VPAC2 in gastrointestinal mucosa(DAB ×200)

A：對照組患兒胃竇黏膜中VPAC2陽性表達(dá)較強(qiáng)，呈棕色染色; B：EG組患兒胃竇黏膜中VPAC2表達(dá)較弱; C：2個組間患兒胃竇黏膜中VPAC2表達(dá)值(A值)的比較,與對照組比較，*P<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))

2.6 EG患者胃竇黏膜中VIP和VPAC2與EOS和IgE水平的關(guān)系

EG患者胃竇黏膜組織中VIP陽性表達(dá)量與胃竇黏膜EOS數(shù)量和外周血總IgE水平均呈明顯負(fù)相關(guān)(rs=-0.81、-0.83，均P<0.01)(圖5)；EG患者胃竇黏膜組織中VPAC2陽性表達(dá)量與胃竇黏膜EOS數(shù)量和外周血總Ig E水平均呈明顯負(fù)相關(guān)(rs=-0.72，P<0.01；rs=-0.77，P<0.05)(圖6)。

3 討 論

EG是以胃腸道EOS異常浸潤為特征的胃腸道疾病，近年來兒童EG的發(fā)生率逐年增高。兒童EG臨床表現(xiàn)多樣，主要臨床癥狀有腹痛、腹瀉、便血、嘔吐、腹脹、腹水等。Khan等[10]根據(jù)EOS累及部位和浸潤深度的不同將EG分為3型：(1)黏膜型(Ⅰ型) 最常見，占整個EG的50%以上，病變主要侵犯胃腸黏膜，表現(xiàn)為蛋白丟失性腸病、出血、吸收不良、生長落后、貧血。(2)肌層型(Ⅱ型) 以肌層病變?yōu)橹?，可引起腸壁增厚及腸梗阻，胃腸痙攣、腹痛、惡心嘔吐等癥狀常頻繁發(fā)生，也可表現(xiàn)為盲腸梗阻或腸套疊。(3)漿膜型(Ⅲ型) 以漿膜下病變?yōu)橹鳎诵洼^少見，占整個EG的10%左右，患者通常表現(xiàn)為腹水，主要為滲出液，含有豐富的外周EOS。這三型EG可單獨(dú)存在，亦可并存。

圖5 EG組患兒胃竇黏膜VIPA值與胃竇黏膜EOS及外周血總IgE水平的關(guān)系

Fig5 Comelations of VIP absorbancy in gastrointestinal mucosa with EOS number or IgE level in EG group

A：胃竇黏膜組織VIPA值與EOS數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.81，P<0.01)； B：胃竇黏膜組織VIPA值與血總Ig E水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.83，P<0.01)(Spearman秩相關(guān)分析)

圖6 EG胃竇黏膜VPAC2 A值與胃竇黏膜EOS及外周血總IgE水平的關(guān)系

Fig6 Comelations of VPAC2 absorbancy in gastrointestinal mucosa with EOS number or IgE level in EG group

A：EG組患兒胃竇黏膜組織VPAC2A值與EOS數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.72，P<0.01)B：EG患兒胃竇黏膜組織VPAC2A值與血總Ig E水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.77，P<0.05)(Spearman秩相關(guān)分析)

本研究納入的20例EG患兒均存在消化道癥狀，其中腹痛最為常見，其余依次為腹瀉、嘔吐、大便帶血、腹脹、腹水、排便困難。本研究20例EG患兒以Ⅰ型為主，僅4例為Ⅲ型，患兒出現(xiàn)腹腔積液且EOS計(jì)數(shù)明顯增加，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ型，其原因可能與胃鏡活檢鉗所能夾取的深度不夠有關(guān)[11-12]。Kinoshita等[13]對144例日本成人EG進(jìn)行分析，患者主要表現(xiàn)為腹瀉(54%)、腹痛(53%)、胸痛(15%)。Reed等[14]報(bào)道了34例美國兒童EG，平均年齡7.9±9.9歲，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐(74%)、腹痛(53%)、腹脹(6%)、腹瀉(29%)及便秘(38%)。楊素芳等[15]報(bào)道了76例中國兒童EG，平均年齡(5.42±3.97)歲，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)腹痛(55.3%)、嘔吐(39.5%)和便血(38.2%)。這些結(jié)果表明，EG的臨床表現(xiàn)除了與EOS累及部位、浸潤深度有關(guān)外，可能也與年齡和地域有關(guān)。

研究表明多數(shù)EG外周血EOS計(jì)數(shù)及總IgE水平升高，且對疾病的嚴(yán)重程度有一定的提示作用[16]。本研究75%的EG患兒外周血EOS計(jì)數(shù)升高，與Kinoshita等[13]的報(bào)道結(jié)論相符。本研究EG患兒中60%外周血總IgE水平明顯高于對照組。

目前EG診斷主要依靠胃腸鏡下多點(diǎn)活檢[14](6個部位及以上)，且常規(guī)病理組織學(xué)檢查示至少有1處EOS>20個/HPF[17]。本研究20例EG患兒胃鏡下表現(xiàn)以黏膜充血水腫為主，其余表現(xiàn)有黏膜糜爛、潰瘍、結(jié)節(jié)樣隆起或增生。胃竇黏膜組織EOS數(shù)量較對照組增多。

VIP作為胃腸黏膜中含量最豐富的神經(jīng)內(nèi)分泌肽之一，對胃腸道病理生理具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患兒血漿中VIP 含量較健康兒童降低，予以外源性VIP治療后，哮喘癥狀得到緩解， VIP基因敲除哮喘小鼠模型和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏并誘發(fā)支氣管哮喘的大鼠模型中得到了相同的結(jié)果[18-20]。目前關(guān)于EG患兒胃竇黏膜中VIP含量與EOS數(shù)量的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測EG患者胃竇黏膜組織中VIP及VPAC2含量，發(fā)現(xiàn)EG組患者胃竇黏膜組織中VIP及VPAC2含量較對照組減少。人體胃腸道黏膜分布著密集的VIP能神經(jīng)纖維，與周圍的肥大細(xì)胞、EOS毗鄰并相互作用，形成神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)[21]。Wu等[22]報(bào)道VIP可以抑制肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)EOS的遷移及產(chǎn)生IL-16。VIP可增強(qiáng)EOS的浸潤，從而導(dǎo)致食管動力障礙，本研究結(jié)果與之不相符。本研究發(fā)現(xiàn)EG患兒胃竇黏膜組織中VIP含量和VPAC2含量分別與胃竇黏膜組織EOS數(shù)量、外周血總Ig E水平均呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，胃竇黏膜VIP含量減少可能與EG的發(fā)生有關(guān)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[23]，VIP能抑制血小板激活因子誘導(dǎo)的EOS嗜酸性過氧化物酶活性的增加效應(yīng), 抑制EOS脫顆粒反應(yīng)，并抑制EOS與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，推測其機(jī)制可能是胃竇黏膜VIP含量減少后其與EOS表面VIP受體2的結(jié)合減少，對EOS與胃竇血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、浸潤的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致胃竇EOS聚集并發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，釋放損傷性介質(zhì)而導(dǎo)致EG的發(fā)生。