CT引導(dǎo)下肺穿刺活檢標本行PCR檢測診斷肺結(jié)核的臨床價值

郭俊紅 武春燕 董正偉 吳偉 張莉萍 李輝 黃焰

結(jié)核病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球結(jié)核病年度報告顯示，全球每年有超過1000萬例新發(fā)結(jié)核病患者，同時有近170萬例患者死于結(jié)核病[1]。受到疾病臨床分期、抗生素大量使用等多種因素影響，痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等的檢測陽性率較低，結(jié)核病診斷困難。近年來，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌成為診斷結(jié)核病的有效手段[2]，而肺細針穿刺細胞學(xué)(fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)病理檢測因其簡單快捷、微創(chuàng)安全而被廣泛應(yīng)用于臨床取樣，可幫助診斷肺部疾病[3-4]。目前兩者聯(lián)合檢測的研究較多，但主要集中在對肺外結(jié)核的診斷[5-7]，對肺結(jié)核診斷效能的研究還較少。本研究采用 CT引導(dǎo)下肺細針穿刺活檢標本行TB-PCR檢測，以探討兩者聯(lián)合在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。

材料和方法

一、 研究對象

1.一般資料：回顧性選取2017年1月至2018年3月同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院曾疑診為肺結(jié)核、后經(jīng)病理證實或試驗性抗結(jié)核藥物治療確診的111例患者，其中肺結(jié)核患者73例(65.8%)，非肺結(jié)核患者38例(34.2%；包括結(jié)節(jié)病3例、肺癌17例、隱球菌感染3例、曲菌感染4例、肺膿腫3例、異物肉芽腫2例，支氣管擴張癥6例)。111例患者均在CT引導(dǎo)下獲取肺穿刺活檢標本行涂片細胞病理學(xué)檢查(簡稱“細胞病理學(xué)檢查”)，其中13例因兩次細胞病理學(xué)檢查不能確診而行CT引導(dǎo)下粗針肺穿刺活檢標本組織病理學(xué)檢查(簡稱“組織病理學(xué)檢查”)；上述標本均同時采用PCR檢測結(jié)核分枝桿菌DNA(分別簡稱為“細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測”與“組織病理學(xué)標本TB-PCR檢測”)。

111例患者中，男71例(64.0%)，女40例(36.0%)；年齡16～79歲，平均(49.9±17.8)歲；臨床表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽、咳痰，伴或不伴消瘦、盜汗、胸痛、胸腔積液等癥狀。73例(65.8%)肺結(jié)核患者中，男48例(65.8%)，女25例(34.2%)；年齡16～79歲，平均(45.2±19.0)歲。以臨床最終診斷為標準，探究細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測診斷肺結(jié)核的檢測效能(敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、正確指數(shù))，以及組織病理學(xué)標本TB-PCR檢測的檢出效用。

2.診斷標準：(1)肺結(jié)核：根據(jù)新版《WS 288—2017肺結(jié)核診斷標準》[8]入組，包括①臨床診斷肺結(jié)核：依據(jù)患者的結(jié)核病病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像學(xué)及實驗室相關(guān)檢查、肺外組織病理及診斷性抗結(jié)核治療效果診斷；②確診患者：依據(jù)痰涂片、痰培養(yǎng)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)檢查診斷。(2)非結(jié)核肺部疾病：對結(jié)核病相關(guān)檢查陰性或存在懷疑體征時，通過再次穿刺、組織學(xué)、細胞學(xué)檢查，根據(jù)病理學(xué)及臨床檢測明確診斷的其他疾病，如肺癌、結(jié)節(jié)病、真菌感染等。

3.病理診斷：對首次細胞病理診斷可疑者再次行細胞病理學(xué)檢查，若兩次均不能確診則穿刺或手術(shù)后取組織樣本行組織病理學(xué)檢查。

二、穿刺細胞病理學(xué)檢查及細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測

1.穿刺及細胞學(xué)制片：由臨床醫(yī)生行CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺，于CT定位點處常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，持22 G×0.7 mm穿刺針穿刺，立即涂片1張投入95%乙醇固定15 min后采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)。針管內(nèi)剩余材料打入液基瓶保存。充分振蕩混勻細胞，去除血凝塊、組織碎塊后，放入離心機890×g離心10 min，棄上清留取沉淀，加入30 ml 液基細胞保存液(CytoRichTM)紅色固定液，振蕩后靜置30 min，890×g離心10 min，倒掉上清并充分振蕩，吸取1～5滴轉(zhuǎn)移至12 ml離心管內(nèi)，加入10 ml緩沖液，890×g離心5 min，倒上清并振蕩，在玻片架上與離心管對應(yīng)的位置上放SurePathTMPreCoat玻片，將吸液管與對應(yīng)的試劑瓶正確連接，運行制片程序。

2.鏡下表現(xiàn)：根據(jù)Bezabih等[9]的研究分型：(1)增殖型：可見類上皮細胞，包括郎罕細胞及組織細胞、淋巴細胞(增殖性肉芽腫)。(2)干酪樣壞死型：可見壞死組織伴或不伴有炎癥背景。(3)混合型：干酪樣壞死型伴有增殖型。

3.判定標準：細胞病理學(xué)檢查診斷結(jié)核病的主要依據(jù)是切片中找到干酪樣壞死物、郎罕細胞和類上皮細胞，若三者同時見于細胞學(xué)切片可診斷結(jié)核病，若只出現(xiàn)1種或2種則為可疑結(jié)核病[10]。

4. 細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測：(1)DNA的提?。簩⒓毎±韺W(xué)標本離心，棄上清留取沉淀，具體操作步驟嚴格按照核酸提取DNA說明書(廈門艾德生物有限公司)進行。(2)Stratagene Mx 3000P型熒光定量PCR儀擴增：按照結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書(北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司)進行。

三、組織病理學(xué)檢查與組織病理學(xué)標本TB-PCR 檢測

1.組織病理學(xué)檢查：由臨床醫(yī)生行CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺，于CT定位點處常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，持18 G×1.2 mm活檢穿刺針穿刺。將穿刺標本放入10%甲醛固定液內(nèi)送病理檢查，經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色制片。

2.病理診斷：組織病理學(xué)診斷結(jié)核病的依據(jù)：特征性病理學(xué)形態(tài)特點(壞死性肉芽腫性病變)及抗酸染色結(jié)果陽性。

3. 組織病理學(xué)標本TB-PCR檢測：將組織病理學(xué)標本進一步切成蠟卷，脫蠟后進行DNA提取，所有操作、儀器、制劑的使用均同細胞病理學(xué)標本TB-PCR 檢測。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致性評價細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測診斷肺結(jié)核的檢測效能。相關(guān)公式：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；正確指數(shù)(或一致性)=敏感度+特異度-1。

結(jié) 果

一、細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測效能

細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測對肺結(jié)核的檢測敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、正確指數(shù)分別為83.6%(61/73)、89.5%(34/38)、93.8%(61/65)、73.9%(34/46)、0.73；單一細胞病理學(xué)檢查肺結(jié)核的檢測敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、正確指數(shù)分別為39.7%(29/73)、94.7%(36/38)、93.5%(29/31)、45.0%(36/80)、0.34，見表1。前者對肺結(jié)核檢測的陽性率(83.6%)明顯高于后者(39.7%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.663，P=0.000)。

二、細胞病理學(xué)標本與組織病理學(xué)標本行TB-PCR 檢測結(jié)果的比較

13例肺結(jié)核患者組織病理學(xué)標本行TB-PCR檢測，陽性者8例；而細胞病理學(xué)標本行TB-PCR檢測陽性者為12例。另外，73例肺結(jié)核患者中有9例經(jīng)穿刺活檢細胞病理學(xué)、組織病理學(xué)檢查均未能診斷出肺結(jié)核，同時傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及熒光抗酸染色檢查等亦均陰性，細胞病理學(xué)標本行TB-PCR檢測后有4例為陽性。此外，本研究有4例患者細胞病理學(xué)標本行TB-PCR 檢測陽性，經(jīng)再次穿刺細胞病理學(xué)檢查診斷為小細胞癌1例、腺癌2例；經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷肺曲菌球病1例。

三、肺結(jié)核不同細胞學(xué)分型患者行TB-PCR檢測結(jié)果分析

臨床最終診斷為肺結(jié)核的73例患者中，鏡下表現(xiàn)為增殖型9例，細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測陽性3例(3/9)；干酪樣壞死型35例，細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測陽性32例(32/35)；混合型29例，細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測陽性26例(26/29)。

討 論

肺結(jié)核至今仍然是嚴重威脅全球人民健康的呼吸道傳染性疾病，近年來結(jié)核病患者例數(shù)呈上升趨勢[1,11-12]，但受患者疾病臨床分期、抗生素大量使用等多種因素影響，細菌學(xué)培養(yǎng)陽性率較低，且診斷周期為4～6周，很難滿足為患者及時制定治療方案的臨床需求[13]。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病與諾卡菌感染在細胞病理學(xué)檢查中形態(tài)學(xué)都可見多核巨細胞及壞死，且諾卡菌抗酸染色亦可呈陽性，但諾卡菌對長周期抗生素治療有效，因此準確的診斷是至關(guān)重要的，需要進行分子病理檢測或培養(yǎng)加以鑒別[14]。為提高我國肺結(jié)核診斷水平，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會[8]重新發(fā)布了新版《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》，在細菌學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，新增了分子生物學(xué)檢查，強調(diào)可以以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確診依據(jù)。

表1 以臨床診斷為標準評價細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測與細胞病理學(xué)檢查的效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；正確指數(shù)(或一致性)=敏感度+特異度-1

細胞病理學(xué)檢查具有易于操作、技術(shù)安全、診斷迅速、準確率高等優(yōu)點[15]，我院開展細胞病理學(xué)檢查10余年，有豐富的細胞病理學(xué)診斷經(jīng)驗，如采用細胞病理學(xué)檢查有明確相關(guān)疾病(包括惡性腫瘤、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、其他良性疾病等)的病理學(xué)診斷，臨床可以根據(jù)該結(jié)果(陽性)為確診依據(jù)制定治療方案；若細胞病理學(xué)檢查不能明確(陰性)診斷，如未見惡性病變依據(jù)或只見肉芽腫病變無法區(qū)分結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、真菌感染等，則同期進行經(jīng)皮肺穿刺、縱隔鏡、胸腔鏡及開胸取活檢組織病理學(xué)檢測為最終診斷依據(jù)[15]。細胞學(xué)病理標本TB-PCR檢測有著較高的敏感度(56%)、特異度(100%)[16]，可將結(jié)核分枝桿菌染色體特異的極微量的DNA擴增百倍以上。本研究對肺結(jié)核細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測的陽性率[83.6%(61/73)]明顯高于單一細胞病理學(xué)檢測肺結(jié)核的陽性率[39.7%(29/73)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.663，P=0.000)。提示在細胞病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上增加TB-PCR檢測可提高肺結(jié)核檢測的陽性率，病理學(xué)檢查醫(yī)生在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)核病證據(jù)后，立即行細胞病理學(xué)標本TB-PCR 檢測，可極大地縮短診斷時間，為臨床治療提供方便。

細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測可能使部分結(jié)核病患者在組織學(xué)活檢和病原學(xué)均陰性的情況下減少進一步的組織學(xué)檢查[16]。本研究對13例肺結(jié)核患者組織病理學(xué)標本行TB-PCR檢測，陽性者8例；而細胞病理學(xué)標本行TB-PCR檢測陽性者為12例，高于前者。表明細胞病理學(xué)標本行TB-PCR檢測的陽性檢出例數(shù)優(yōu)于前者，有利于降低臨床穿刺風(fēng)險及減少術(shù)后并發(fā)癥。但是由于樣本量小，檢驗結(jié)果可能存在偏倚，今后需進一步收集更多樣本加以驗證。此外，本次研究肺結(jié)核患者中有9例經(jīng)穿刺活檢組織病理學(xué)檢查未獲得診斷依據(jù)，同時傳統(tǒng)技術(shù)(痰涂片抗酸染色及痰培養(yǎng))檢測結(jié)果亦陰性，其中4例經(jīng)細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測呈陽性，進一步提示細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測可減少進一步的組織病理學(xué)檢查。

結(jié)核病常見的組織病理學(xué)改變?yōu)閴乃佬匀庋磕[性炎，但亦可為非壞死性肉芽腫性炎，亦可見缺少肉芽腫病變的干酪樣壞死結(jié)節(jié)，典型的結(jié)核結(jié)節(jié)中心為干酪樣壞死，周邊可見類上皮細胞和(或)郎罕細胞，外周有纖維結(jié)締組織和慢性炎細胞浸潤。本研究鏡下細胞病理學(xué)與組織病理學(xué)形態(tài)相符，病變內(nèi)可見類上皮細胞、干酪樣壞死及郎罕細胞[17]。本研究根據(jù)細胞學(xué)形態(tài)分為增殖型、混合型及干酪樣壞死型[9]。本研究73例肺結(jié)核患者中，細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測出陽性患者干酪樣壞死型(32例，32/35)及混合型(26例，26/29)的比例高于增殖型(3例，3/9)，可能與增殖期荷菌量少、毒力低，而此時人體免疫力還較強，結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核結(jié)節(jié)形成過程中被及時清除有關(guān)。本研究仍有12例患者細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測陰性，可能與部分患者(7例)正在或既往進行過抗結(jié)核藥物治療有關(guān)；導(dǎo)致病灶標本中結(jié)核分枝桿菌菌量少而難以檢出，另外，穿刺活檢組織位于壞死中心或穿刺時引起出血等均可明顯干擾結(jié)核分枝桿菌DNA的提取。

研究表明，肺結(jié)核并發(fā)肺癌的發(fā)生率為0.22%～2.7%，并且呈逐年增加的趨勢[18]，抗結(jié)核和抗腫瘤雙重治療可改善患者預(yù)后[19-20]。對于肺癌并發(fā)肺結(jié)核的患者，兩病具有相似的臨床癥狀和影像學(xué)特征，易被誤診、漏診而影響治療時機[21]。曲球菌常寄生于許多肺部病變構(gòu)成的空洞或空腔中，如肺結(jié)核空洞、慢性肺膿腫、肺癌等[22]，也常為肺結(jié)核的并發(fā)疾病。本研究有4例細胞學(xué)病理標本TB-PCR檢測陽性，經(jīng)再次穿刺細胞病理學(xué)檢查診斷為小細胞癌1例、腺癌2例；經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷曲菌球1例。因穿刺活檢標本行細胞學(xué)檢查及組織學(xué)檢查時穿刺部位較局限，不能排除存在肺結(jié)核并發(fā)肺癌、曲菌球感染的情況，但在可能存在并發(fā)疾病的情況下及時發(fā)現(xiàn)及治療肺結(jié)核非常必要，細胞病理學(xué)標本及組織病理學(xué)標本行TB-PCR檢測可簡便、快速地幫助診斷肺結(jié)核。

綜上所述，細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測是診斷肺結(jié)核的有效手段，在細胞病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上增加細胞病理學(xué)標本TB-PCR檢測可提高肺結(jié)核檢測的陽性率，在肺結(jié)核的病理診斷中具有良好的應(yīng)用價值。