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    實時熒光聚合酶鏈式反應檢測肉制品中的鴨源性成分

    2018-11-20 10:59:18張秀平
    肉類研究 2018年7期
    關(guān)鍵詞:鴨肉靈敏度

    摘 要:通過鴨的肌動蛋白β-actin保守基因設(shè)計可特異檢測鴨肉成分的引物和探針,建立實時熒光聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)檢測鴨肉的方法,并通過模擬肉樣和市售樣品檢測方法的準確性和適用性。結(jié)果表明:該方法可以特異性檢測出麻鴨和草鴨成分,而對豬、牛、羊、雞等DNA均沒有擴增,檢測靈敏度可達到1 pg DNA;通過模擬肉樣檢測確定最低質(zhì)量分數(shù)檢測限為0.01%;市售樣品的檢測結(jié)果表明,該方法能很好地應用于市場,滿足市場檢測需求。

    關(guān)鍵詞:實時熒光聚合酶鏈式反應;鴨肉;靈敏度;檢測限

    Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products by Real-time Fluorescent Polymerase Chain Reaction

    ZHANG Xiuping1, MIAO Li2,*

    (1.Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine, Zhengzhou 450003, China;

    2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China)

    Abstract: According to the conserved sequence of the duck β-actin gene, specific primers and probes were designed, and a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for detecting duck-derived ingredients in meat products. Its accuracy and applicability were evaluated using model and commercial meat samples. Results showed that this method could specifically detect duck-derived ingredients and could not amplify porcine, bovine, ovine and chicken DNA. Its limit of detection was 1 pg of DNA. The minimum detectable level was 0.01% for model meat samples. The results obtained from detection of commercial meat samples showed that this method can meet the requirements for the requirements for the detection of duck-derived components in meat products.

    Keywords: real-time fluorescent polymerase chain reaction; duck; sensitivity; detection limit

    DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201807007

    中圖分類號:TS207.3 文獻標志碼:A 文章編號:1001-8123(2018)07-0037-05

    引文格式:

    食品的質(zhì)量和安全問題日益成為社會關(guān)注的焦點,隨著人們生活水平的提高,肉制品消費已經(jīng)成為食品消費的重要組成[1-3],而目前利用摻雜摻假、以次充好等手段制造“假羊肉”、“假牛肉”事件屢屢出現(xiàn)[4]。檢驗檢疫部門有必要加強對于肉及肉制品的檢測,以確保國內(nèi)消費者的權(quán)益得到保護。

    在食品中動物源性成分鑒定方面,實時熒光聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)憑借其高度靈敏性和特異性,已逐步成為肉類成分鑒別的重要技術(shù)[5-7]。楊麗霞等[8]根據(jù)鴨線粒體基因序列的位點差異設(shè)計特異性引物,采用SYBR Green Ⅰ染料,通過溶解曲線分析,建立熒光定量PCR檢測方法。史艷宇等[9]以鴨線粒體基因全序列為靶位點設(shè)計引物和探針,建立鴨源性成分檢測方法,檢測靈敏度可達0.1 μg/kg。

    β-actin基因是構(gòu)成細胞骨架的主要成分,具有基因序列高保守性,并且在不同組織間可以穩(wěn)定表達[10-12]。當前研究中多選用線粒體基因,線粒體DNA由于豐度高且在不同組織部位的含量不一致,容易導致定量結(jié)果偏差較大,而β-actin基因作為單拷貝基因,具有基因序列高保守性,在肉源性成分定性及定量方面具有重要參考價值。

    本研究通過從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找序列并設(shè)計鴨特異的PCR引物和探針,建立快速、準確的實時熒光PCR技術(shù)檢測方法,為食品市場檢測構(gòu)建技術(shù)平臺。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    生鮮鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉以及鴨肉制品

    鄭州市某農(nóng)貿(mào)市場;蛋白酶K(20 mg/mL) 日本TaKaRa公司;Tris-飽和酚、氯仿-異戊醇(24∶1) 北京

    索萊寶生物科技有限公司;組織裂解液(1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS))、75%無水乙醇 自配;所有試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ABI 7500熒光定量PCR儀 美國應用生物系統(tǒng)公司;DT500電子天平 江蘇常熟長青儀器廠;Hermle Z36HK高速冷凍離心機 德國哈默公司;NTS-4000AM恒溫振蕩水槽 上海斯信有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DNA提取

    采用酚-氯仿法提取樣品的基因組DNA,具體步驟參考文獻[13-14]進行,最后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA,然后采用核酸定量測定儀測定提取肉樣的DNA含量。

    1.3.2 引物和探針設(shè)計

    通過核酸比對軟件DnamaN對GenBank中公布的多個物種的β-actin基因共17 個序列進行比對,其中包括5 個鴨源β-actin基因(GenBank中的登錄號分別為EF667345.1、NM_001310421.1、GU564232.1、AY251275.1和DQ675572.1)、3 個雞源β-actin基因(GenBank中的登錄號分別為L08165.1、NM_205518.1和JF436880.1)、3 個豬源β-actin基因(GenBank中的登錄號分別為DQ452569.1、DQ845171.1和U07786.1)、3 個羊源β-actin基因(GenBank中的登錄號分別為NM_001009784.1、U39357.1和AF035422.1)、2 個牛源β-actin基因(GenBank中的登錄號分別為AY141970.1和BT030480.1)和1 個鵝源β-actin基因(GenBank中的登錄號為M26111.1),篩選出鴨β-actin基因的特異序列,并運用Primer 5.0軟件(加拿大Premier開發(fā)公司)設(shè)計鴨源性成分的特異性引物和探針。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物和探針序列如表1所示。

    1.3.3 熒光PCR反應程序

    反應體系為25 μL:2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL(反應體系終濃度0.2 μmol/L)、探針1 μL(反應體系終濃度

    0.4 μmol/L)、DNA模板2 μL,其余用滅菌雙蒸水補齊。反應循環(huán)參數(shù)為:95 ℃、5 min,95 ℃、10 s,58 ℃、45 s;40 個循環(huán)。

    1.3.4 引物與探針的特異性驗證

    以從豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉中提取的DNA作為模板,進行實時熒光PCR反應,以驗證所設(shè)計各引物和探針體系的特異性。

    1.3.5 靈敏度實驗

    提取純鴨肉粉DNA,調(diào)整DNA模板的初始質(zhì)量濃度為100 ng/μL,用滅菌雙蒸水分別進行10 倍倍比稀釋,然后分別取2 μL各稀釋度的稀釋液為模板,同時設(shè)置陰性對照,進行實時熒光PCR,檢測所設(shè)計引物、探針的靈敏度。

    1.3.6 檢測下限的確定

    取總質(zhì)量為10 g的肉粉,在雞肉基質(zhì)中添加質(zhì)量分數(shù)為0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的鴨肉粉,用研磨機進行混樣,得到梯度質(zhì)量分數(shù)的鴨肉粉樣品;稱取100 mg樣品進行DNA提取和熒光PCR擴增,根據(jù)實驗結(jié)果確定檢測下限。

    1.3.7 市售樣品的檢測

    為驗證該方法在實際樣品檢測中的可應用性,購買市售的10 個生產(chǎn)廠家的鴨肉加工制品,運用本方法進行驗證,同時運用SN/T 3731.5—2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分 鴨成分檢測 PCR法》[15]中的方法進行驗證,比較實驗結(jié)果是否一致。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,利用Excel軟件進行圖表編輯,采用聯(lián)合國糧農(nóng)組織(United Nations Food and Agriculture Organization,F(xiàn)AO)方法規(guī)定統(tǒng)一的檢測數(shù)據(jù)評價標準,即相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)≤25%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA提取與濃度測定

    提取DNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.7~2.0之間,完全符合實時熒光PCR的要求。

    2.2 特異性測定結(jié)果

    由圖1可知,麻鴨和草鴨的DNA均有擴增,而豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉等其他物種的DNA均沒有擴增,表明鴨的引物和探針特異性良好,可以用于熒光PCR檢測。

    2.3 靈敏度測定結(jié)果

    分別利用麻鴨和草鴨的5 個質(zhì)量濃度梯度的DNA稀釋液(0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/?L)為模板,對建立的實時熒光PCR檢測體系進行靈敏度實驗和可重復性分析。

    由表2~3可知:當樣品質(zhì)量濃度為0.000 1 ng/?L時,在20 次擴增反應中,麻鴨和草鴨陽性擴增次數(shù)分別為4 次和9 次,不滿足檢出率≥95%(即20 次擴增,陽性結(jié)果≥19 次);當樣品質(zhì)量濃度為0.000 5 ng/?L時,在20 次擴增反應中,所有鴨樣本均得到20 次陽性結(jié)果,滿足檢出率≥95%,且RSD≤25%,故鴨樣品可穩(wěn)定檢出的最低質(zhì)量濃度均為0.000 5 ng/?L,即最低DNA質(zhì)量濃度為1 pg DNA(模板量2 ?L)。

    2.4 方法檢測限

    由圖2和表4可知:當雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)為0.01%時,3 次平行測定中均能夠檢出鴨源性成分,平均Ct值34.97;而當雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)為0.001%時,平均Ct值38.18,數(shù)值較高,不利于判定,因此本方法檢測雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)檢出限為0.01%。

    2.5 市售樣品的檢測

    由圖3可知,6 份標識有鴨成分的加工品中能夠檢出鴨源性的為5 份,其中1 份未檢出麻鴨和草鴨成分,與標準檢測結(jié)果一致,表明市面上可能存在假冒的鴨肉產(chǎn)品。

    3 討 論

    動物產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及畜牧業(yè)的健康發(fā)展,其安全和質(zhì)量越來越受到公眾的關(guān)注,而傳統(tǒng)的依靠感官和經(jīng)驗鑒別的手段已經(jīng)不能滿足市場需求,建立準確、快速、有效的動物源性成分檢測方法是研究熱點[16-18]。

    基于PCR和實時熒光PCR方法檢測飼料和肉制品中的動物源性成分已得到了較多關(guān)注和研究[19-20]。何瑋玲等[21]運用動物細胞色素b(cytochrome b,cytb)基因的差異性位點,建立了豬、牛、羊和雞的快速鑒別方法;陳冬等[22]運用牛線粒體12S rRNA基因設(shè)計通用引物,成功鑒別混合鮮牛肉及制品中的牛種來源,但是對于鴨源成分的檢測研究不多。曲莉等[23]采用改良鹽析法和柱層析法有效提取鴨肉的mtDNA,通過在GenBank中下載綠頭鴨線粒體cytb基因序列進行比對,設(shè)計檢測鴨源成分的引物,擴增產(chǎn)物大小為223 bp。SN/T 3731.5—2013以及楊滴等[24]的研究主要應用普通PCR技術(shù)對鴨源性成分進行檢測,普通PCR技術(shù)費時費力,容易污染,逐步被熒光定量PCR方法取代[25-27]。因此,迫切需要建立新的鴨源性成分檢測方法及標準,以滿足實際檢測的需要。

    動物特異性基因具有物種特異性,有望成為肉類成分定性檢測的良好靶點[28-30]。本研究根據(jù)羊、牛、豬、雞、鵝5 種動物肌動蛋白β-actin基因序列的位點差異設(shè)計鴨特異性引物和探針,進行熒光定量PCR擴增檢測。結(jié)果表明,所篩選的引物和探針只對鴨的DNA產(chǎn)生特異性擴增曲線,而與豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉10 種動物的DNA無擴增,特異性較好。通過對DNA梯度稀釋液進行測定顯示,該方法的重復性好,靈敏度可低至1 pg,避免了因提取過程中DNA含量過低而出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。而在實際檢測中,肉制品中鴨源成分的質(zhì)量分數(shù)更能接近市場需求,因此,本研究通過制作模擬肉樣,確定了最低檢出質(zhì)量分數(shù),為我國肉制品市場的規(guī)范化和有序化管理提供了必要的技術(shù)支撐,對政府部門的監(jiān)督管理工作具有重要意義。

    4 結(jié) 論

    本研究利用鴨的β-actin基因保守序列,建立用于檢測鴨成分的實時熒光PCR方法。經(jīng)測試,建立的檢測方法特異性強、靈敏度高,方法檢測限為1 pg DNA和質(zhì)量分數(shù)0.01%,且具有良好的可重復性,能夠滿足日常檢測的需求。對于市售樣品的檢測結(jié)果表明,5 份標注含鴨成分的實際樣本中均能檢出鴨成分,有1 份包裝鹵鴨肉產(chǎn)品未檢出鴨成分,表明產(chǎn)品可能存在摻假現(xiàn)象。

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