超聲波輔助酶解法提取食用豬油工藝優(yōu)化及膽固醇脫除

摘 要：為開發(fā)豬油的提取新工藝，以豬脂肪組織為原料，采用超聲波輔助中性蛋白酶酶解法提取食用豬油。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以豬油的提取率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法研究蛋白酶添加量、酶解時間、超聲波功率和超聲時間對豬油提取率的影響，并通過吸附條件的優(yōu)化，研究β-環(huán)糊精、羧甲基纖維素及馬鈴薯變性淀粉3 種吸附劑對豬油膽固醇的脫除效果。結(jié)果表明：各因素對豬油提取率的影響從大到小依次為蛋白酶添加量>酶解時間>超聲波功率>超聲時間；超聲波輔助酶解提取食用豬油的最優(yōu)工藝為蛋白酶添加量550 U/g、酶解時間80 min、超聲波功率720 W、超聲時間120 s，在此條件下，豬油的提取率為（95.14±1.65）%；3 種吸附劑對豬油膽固醇均具有明顯的吸附效果，脫除能力依次為β-環(huán)糊精>羧甲基纖維素>馬鈴薯變性淀粉。

關(guān)鍵詞：超聲波；酶解法；食用豬油；膽固醇脫除

Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Lard and Cholesterol Removal from It

QI Biao， MI Ruifang， XIONG Suyue， CHEN Xi， LI Jiapeng， YANG Junna， LI Jinchun， QIAO Xiaoling， WANG Shouwei*

（Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， State Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100068， China）

Abstract： In order to develop a new process for lard extraction， ultrasonic-assisted neutral protease hydrolysis was used to extract lard oil from pig adipose tissue. The effects of ultrasonic power， ultrasonic time， enzyme dosage and hydrolysis time on the extraction efficiency of lard were investigated by one-factor-at-a-time and orthogonal array design. The removal efficiency of cholesterol from lard by three different absorbents： β-cyclodextrin， carboxylcellulose and modified potato starch was evaluated under optimized adsorption conditions. The results showed that the factors affecting the extraction efficiency of lard oil in descending order of importance were enzyme dosage， hydrolysis time， ultrasonic power， and ultrasonic time. The optimized processing parameters were as follows： enzyme dosage 550 U/g， hydrolysis time 80 min， ultrasonic time

120 s， and ultrasonic power 720 W. Under the optimal conditions， the extraction efficiency of lard was （95.14 ± 1.65）%. All three adsorbents had a significant effect on cholesterol removal from lard and their effect was in the following decreasing order： β-cyclodextrin， carboxylcellulose and modified potato starch.

Keywords： ultrasonic wave； enzymatic； lard oil for food； cholesterol removal

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807005

中圖分類號：TS224.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）07-0023-06

引文格式：

戚彪， 米瑞芳， 熊蘇玥， 等. 超聲波輔助酶解法提取食用豬油工藝優(yōu)化及膽固醇脫除[J]. 肉類研究， 2018， 32（7）： 23-28. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807005. http：//www.rlyj.pub

QI Biao， MI Ruifang， XIONG Suyue， et al. Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic extraction of lard and cholesterol removal from it[J]. Meat Research， 2018， 32（7）： 23-28. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807005. http：//www.rlyj.pub

我國豬肉生產(chǎn)量位居世界首位，伴隨著豬肉生產(chǎn)量的增加，豬脂肪產(chǎn)量也在不斷上升[1]。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[2]顯示，2017年，我國的豬肉產(chǎn)量達(dá)到5 340 萬t，占世界總產(chǎn)量的49.25%。與如此龐大的豬肉生產(chǎn)量對應(yīng)的是生豬屠宰量的不斷攀升，2017年我國生豬屠宰量為47 334 萬頭，占世界生豬屠宰量的59.35%。隨著屠宰量的不斷增加，生豬屠宰產(chǎn)生的五花豬油產(chǎn)量達(dá)1 100多萬t，豬板油產(chǎn)量也達(dá)到2 800多萬t。豬油營養(yǎng)豐富，含有大量的飽和脂肪酸和高級多烯酸，這些脂肪酸在植物油脂中含量很少，是人體必需脂肪酸和脂溶性維生素的重要來源，豬油中含有的α-脂蛋白和花生四烯酸在人體中具有重要功能性[3]。

豬油風(fēng)味獨(dú)特，用途廣泛，烹調(diào)過程中加入豬油可使食物產(chǎn)生細(xì)膩的口感和誘人的風(fēng)味[4]。

目前，豬油的煉制方法主要采用熔煉法，熔煉法分為干法熔煉和濕法熔煉，其中：干法熔煉是通過高溫將脂肪組織中的油脂溶出，經(jīng)過過濾、壓榨、精煉制得食用豬油；濕法熔煉是使脂肪與水或冷凝水蒸氣直接接觸，通過蒸煮溶出油脂。然而，傳統(tǒng)的干法熔煉溫度高、時間長，所得煉豬油的顏色較深，且酸價、過氧化值和丙二醛含量均較高；濕法熔煉獲得的豬油水分含量高、風(fēng)味差、易酸敗。此外，熔煉法還存在出油率低、能耗高、提取豬油后的油渣和油腳利用價值低，廢棄后易污染環(huán)境等問題[5-6]，

因此需要開發(fā)一種更好的提煉方法。

超聲波提取是利用超聲波振動產(chǎn)生的空化、機(jī)械破碎等作用來加速細(xì)胞組織的破壞，從而加速油脂從細(xì)胞中溶出的一種提取方法[7-8]。酶解法提取可以在溫和的條件下酶解油料細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等組織，使油脂從油料中分離出來，具有出油率高、油品質(zhì)好、能耗低、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[9]。近年來，利用超聲波輔助酶解提取植物性油脂的報(bào)道較多，如利用超聲波輔助酶解法提取米糠油[10]、藍(lán)莓籽油[11]、茶葉籽油[12]、橄欖油[13]等植物性油脂，具有很好的提取效果。而利用超聲波輔助酶解提取動物油脂的報(bào)道還較少。

豬油用途廣泛，且具有獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，但是普通豬油中膽固醇含量較高[14]，不利于消費(fèi)者的身體健康。盡管膽固醇是人體維持生命和正常生理功能所必需的一種營養(yǎng)成分，是構(gòu)成細(xì)胞膜的組成成分之一，也是體內(nèi)合成性激素和腎上腺素的原料[15-16]，但通過膳食攝取的膽固醇會提高血液中膽固醇的含量，大大增加人體罹患心腦血管疾病的風(fēng)險[17-18]。因此，采用合理的方法降低豬油中膽固醇的含量，對提高豬油的食用價值和健康性很有必要。目前，用于降低油脂中膽固醇含量的方法有物理法（如物理吸附法）[19-21]、化學(xué)法（如酶解法）[22]和生物法（如微生物法）[23]，其中物理吸附法具有操作簡單、脫除成本低、無帶入、不破壞油脂的特點(diǎn)，是研究最多的膽固醇脫除方法。已有研究中的膽固醇吸附劑主要包括甲氧基果膠、植物甾醇、高纖維素、植物膳食纖維、皂苷和活性白土[24-26]等，這些吸附劑對膽固醇均具有一定的吸附作用，然而它們的吸附過程不具有選擇性，通常在脫除膽固醇的同時會也將油脂的風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)帶走，存在一定的弊端。目前，已經(jīng)研究的的用于豬油膽固醇脫除的吸附劑有β-環(huán)糊精、活性白土、植物膳食纖維、變性淀粉、黃原膠及活性氧化鋁等[27-29]。

本研究利用超聲波輔助酶解法提取食用豬油，并利用正交法優(yōu)化提取工藝，此外，根據(jù)食用豬油中膽固醇的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[30]，研究利用吸附劑脫除豬油中膽固醇的方法，以期為豬油的高效提取及低膽固醇油脂的開發(fā)利用提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背脂（-18 ℃冷凍貯藏） 北京二商大紅門食品有限公司；中性蛋白酶（最適溫度40 ℃，最適

pH 7.0～7.8，酶活力60 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司；石油醚、無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鉀、冰乙酸、磷酸（均為分析純）、β-環(huán)糊精、羧甲基纖維素、馬鈴薯變性淀粉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；721分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；LYNX 4000冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；SSY-H恒溫水浴鍋 上海紅葉儀器有限公司；JJ-1電動攪拌機(jī) 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬油提取工藝

以中性蛋白酶為水解用酶，研究超聲波輔助酶解法提取豬油的工藝，具體工藝流程為：豬脂肪組織→

絞碎→水浴預(yù)熱→加入中性蛋白酶→恒溫酶解→超聲波輔助酶解→離心→分離油層→精煉→豬油

1.3.2 豬油提取率的計(jì)算

采用GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》中的索氏抽提法測定脂肪組織的總脂肪質(zhì)量。豬油提取率按照下式計(jì)算。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響蛋白酶解和超聲效果的主要因素有超聲波功率、超聲時間、蛋白酶添加量和酶解時間等。選取這4 個因素，以豬油提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的適宜范圍。各因素水平分別為：蛋白酶添加量100、200、300、400、500、600、700、800 U/g；酶解時間10、20、30、40、50、60、70、80、90 min；超聲波功率90、180、270、360、450、540、630 W；超聲時間60、70、80、90、100、110、120 s。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化超聲波輔助酶解提取豬油的工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化出超聲波輔助酶解法提取食用豬油的最佳提取工藝。

1.3.5 吸附法脫除膽固醇

稱取100 g豬油，將不同質(zhì)量的β-環(huán)糊精、羧甲基纖維素、馬鈴薯變性淀粉與豬油混勻，置于60 ℃恒溫水浴中，用恒速攪拌器持續(xù)攪拌，吸附60 min后，取出樣品進(jìn)行離心，離心條件為4 200×g、15 min，上清液即為脫膽固醇后豬油。

1.3.6 膽固醇含量測定

膽固醇含量測定參照GB/T 5009.128—2003《食品中膽固醇的測定》。將豬油樣品加入25 mL試管中，加入無水乙醇和氫氧化鉀溶液，在恒溫水浴中皂化；皂化完成后加入氯化鈉溶液和石油醚反復(fù)振蕩，靜置分層；取上層石油醚2 mL于具塞試管內(nèi)，水浴中氮?dú)獯蹈?，加入冰乙酸和鐵礬顯色液，混勻靜置后測定樣品在575 nm波長處的吸光度，然后對比標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的膽固醇含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，每個處理組做3 個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助酶解法提取食用豬油的工藝優(yōu)化

豬的脂肪組織是由脂肪細(xì)胞組成的，通常脂肪細(xì)胞借助于疏松的結(jié)締組織成群地連接在一起，脂肪細(xì)胞中充滿脂肪滴。豬油的提取過程就是破壞脂肪細(xì)胞，使油脂從細(xì)胞中溶出的過程。采用蛋白酶酶解脂肪細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，同時在超聲波作用下加速細(xì)胞的破裂，使油脂從脂肪細(xì)胞中釋放出來，最后分離出豬油。

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 蛋白酶添加量對豬油提取率的影響

影響酶解效果的因素很多，蛋白酶的種類與原料不同，酶解的效果也不盡不同。根據(jù)榮輝等[31]的研究，綜合考慮酶解條件、油脂品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)成本等因素，選擇中性蛋白酶對豬脂肪組織進(jìn)行酶解。

由圖1可知，蛋白酶的添加量對豬油提取率影響顯著（P<0.05），隨著酶添加量的增加，豬油的提取率不斷上升，這與超聲波輔助水酶法提取蠶蛹油的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[32]，這主要是由于在底物濃度固定時，與底物作用的酶量越大，酶解速度越快，酶解程度越高。當(dāng)酶的添加量大于500 U/g時，提取率的上升趨勢趨于平緩。綜合考慮提取效率和經(jīng)濟(jì)成本，選取500 U/g的蛋白酶添加量，此時豬油提取率可達(dá)72.57%。

2.1.1.2 酶解時間對豬油提取率的影響

酶解時間的長短是決定細(xì)胞酶解破碎程度的關(guān)鍵因素[33]。采用中性蛋白酶，在酶解溫度為40 ℃、pH值為7.0、料液比1∶1、蛋白酶添加量為500 U/g的條件下，研究酶解時間對豬油提取率的影響。

由圖2可知，酶解時間對豬油提取率影響顯

著（P<0.05）。隨著酶解時間的延長，豬脂肪細(xì)胞破碎程度變大，脂肪更容易從細(xì)胞中釋放，豬油的提取率也隨之升高；但是當(dāng)酶解時間達(dá)到60 min后，隨著酶解時間的延長，豬油提取率的上升趨勢開始減緩，這主要是由于酶與底物的作用已經(jīng)比較徹底，脂肪細(xì)胞的破裂程度比較完全。綜合考慮提取率、生產(chǎn)周期和生產(chǎn)成本等因素，選取酶解時間為60 min。

2.1.1.3 超聲波功率對豬油提取率的影響

酶解過程中，利用超聲波的空化效應(yīng)來加速物質(zhì)分子的運(yùn)動頻率和速度，增加酶與底物的接觸概率，加快酶解速率，提高油脂的提取效率，而超聲波的次級效應(yīng)，如機(jī)械振動、破碎、擴(kuò)散、穿透性又能加速脂肪細(xì)胞的破碎，有利于油脂的釋放和分離[34]。超聲波功率是影響超聲效果的關(guān)鍵因素[35]。

在酶解溫度40 ℃、pH值7.0、料液比1∶1、蛋白酶添加量500 U/g、酶解時間60 min條件下，設(shè)定超聲波的頻率為20 kHz，超聲時間為100 s，超聲波開啟與間歇交替進(jìn)行，其中開啟和間歇時間分別為5 s和25 s，此時研究超聲波功率對豬油提取率的影響。

由圖3可知，超聲波功率對豬油的提取率影響顯

著（P<0.05）。隨著超聲功率的提高，豬油的提取率逐漸上升；當(dāng)超聲破碎功率大于540 W后，豬油的提取率出現(xiàn)下降，這可能是由于超聲波功率過高時，過高的分子振動和熱效應(yīng)會使酶分子遭到破壞，從而影響酶解反應(yīng)，導(dǎo)致豬油提取率下降。綜合考慮，超聲波功率選取540 W。

2.1.1.4 超聲時間對豬油提取率的影響

酶解過程中，利用超聲波加速脂肪組織蛋白的酶解，同時促進(jìn)脂肪細(xì)胞的破碎。除超聲功率外，超聲時間也是影響提取效果的重要因素。在酶解溫度40 ℃、pH值7.0、料液比1∶1、蛋白酶添加量500 U/g條件下，設(shè)定超聲波頻率為20 kHz，超聲波功率為540 W，超聲波開啟與間歇交替進(jìn)行，其中開啟與間歇時間設(shè)定為5 s和25 s，此時研究超聲時間對豬油提取率的影響。

由圖4可知，超聲破碎時間對豬油的提取率影響顯著（P<0.05）。隨著超聲時間的延長，豬油的提取率不斷上升；當(dāng)超聲時間大于100 s后，豬油的提取率上升趨于平緩，這可能是由于經(jīng)過100 s的超聲，脂肪細(xì)胞的破碎程度已經(jīng)較為徹底。綜合考慮提取效率和生產(chǎn)周期等因素，超聲時間選取100 s。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)確定豬油的超聲輔助酶解提取優(yōu)化方案。選擇對豬油提取率影響明顯的蛋白酶添加量、酶解時間、超聲波功率和超聲時間4 個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果如表1～2所示。

由表2～3可知：以蛋白酶添加量、酶解時間、超聲波功率和超聲時間4 個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，豬油的提取率有明顯提高，其中第12號試驗(yàn)組的實(shí)際提取率最高，達(dá)92.61%；正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4 個因素對豬油超聲波輔助酶解法提取率的影響大小順序?yàn)锳（蛋白酶添加量）>B（酶解時間）>C（超聲波功率）>D（超聲時間）；方差分析結(jié)果表明，因素A、B對豬油提取率有極顯著影響（P<0.01），因素C對豬油提取率有顯著影響（P<0.05），因素D對豬油提取率影響不顯著。較優(yōu)組合為A3B4C4D4，即蛋白酶添加量550 U/g、酶解時間80 min、超聲波功率720 W、超聲時間120 s。該組合不包含在正交表排出的試驗(yàn)方案中，需進(jìn)一步確認(rèn)和驗(yàn)證最優(yōu)工藝條件。

2.1.3 最優(yōu)提取工藝的確認(rèn)和驗(yàn)證

按照正交試驗(yàn)所得最優(yōu)方案A3B4C4D4進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過3 次平行實(shí)驗(yàn)，所測得豬油的提取率分別為93.34%、96.58%和95.50%，平均值為（95.14±1.65）%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用理論分析得到的最佳方案提取豬油的提取率高于正交試驗(yàn)中的第12號試驗(yàn)組。最終可確定豬油的最佳提取工藝為蛋白酶添加量550 U/g、酶解時間80 min、超聲波功率720 W、超聲時間120 s。

2.2 豬油脫膽固醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別選取對膽固醇具有較好吸附效果的羧甲基纖維素、β-環(huán)糊精[20]和馬鈴薯變性淀粉[36]作為吸附劑，研究3 種不同吸附劑對豬油膽固醇的脫除效果，從而找到較好的膽固醇脫除劑和脫除方法，開發(fā)低膽固醇食用豬油。

由圖5可知，3 種吸附劑對豬油中的膽固醇均具有顯著（P<0.05）脫除效果。隨著吸附劑添加量的增加，膽固醇的脫除效果變好，當(dāng)吸附劑添加量達(dá)到5%時，膽固醇的脫除率可達(dá)到較低水平。3 種吸附劑的脫除效果為β-環(huán)糊精>羧甲基纖維素>馬鈴薯變性淀粉，這主要是由于β-環(huán)糊精具有特殊分子結(jié)構(gòu)，能形成一種環(huán)狀物[19]，微觀表面結(jié)構(gòu)及環(huán)形孔徑對膽固醇具有較好的包埋效果[36]。

3 結(jié) 論

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化超聲波輔助中性蛋白酶酶解法提取豬油的工藝，各因素對豬油提取率影響的大小依次為蛋白酶添加量>酶解時間>超聲波功率>超聲時間，最優(yōu)工藝條件為蛋白酶添加量550 U/g、酶解時間80 min、超聲波功率720 W、超聲時間120 s，在此條件下，豬油的提取率為（95.14±1.65）%。

采用物理吸附法可將豬油中膽固醇含量降至17.82 mg/100 g，3 種吸附劑的脫除能力依次為β-環(huán)糊

精>羧甲基纖維素>馬鈴薯變性淀粉。

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