RCAS1基因與乳腺癌相關(guān)性分析

覃新干,黨裔武,韋康來,劉金祿,張小彬

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021）

乳腺癌是目前威脅女性健康的主要因素，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球女性新發(fā)乳腺癌病例數(shù)和乳腺癌死亡病例數(shù)均位居各類癌癥的首位。我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病高峰在45～60歲，有年輕化的趨勢(shì)[1]。近年來，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度是全球的2倍多，特別在城市地區(qū)，像大多數(shù)其他國(guó)家一樣，乳腺癌是我國(guó)女性最常見的癌癥[2]。研究乳腺癌的發(fā)生及預(yù)防乳腺癌的發(fā)生更顯為重要和迫切。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，研究者越來越意識(shí)到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是腫瘤細(xì)胞與宿主之間相互對(duì)抗和博弈的過程，宿主細(xì)胞與腫瘤之間的相互作用對(duì)腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)歸具有關(guān)鍵的影響，而宿主的免疫系統(tǒng)和其形成的免疫微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用。SiSo細(xì)胞上的受體結(jié)合腫瘤抗原（receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells，RCAS1）是一種新的腫瘤相關(guān)抗原，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，影響癌組織間質(zhì)微環(huán)境的作用[3]。那么，RCAS1與乳腺癌的發(fā)生是否有關(guān)系呢？本文通過免疫組化檢測(cè)RCAS1基因在乳腺癌組織的表達(dá)情況，初步探討其與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月～2015年10月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院并手術(shù)治療的105例乳腺癌患者的癌組織、癌旁組織及年齡、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)等臨床病理資料。所有患者術(shù)前均無(wú)化療、放療及免疫治療等，病理學(xué)診斷均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。全部為女性患者，年齡24～81歲。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色后病理學(xué)檢查確定。

1.2 主要試劑 RCAS1抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ生物技術(shù)有限公司，SupervisionTM鼠、兔通用二抗檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物科技有限公司。

1.3 方法 免疫組化染色參照抗體說明書操作，4疫組常規(guī)石蠟組織切片65℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。將切片浸入預(yù)熱至沸騰的檸檬酸鈉修復(fù)液中，繼續(xù)加熱至高壓鍋閥門上汽后計(jì)時(shí)2.5 min，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS浸洗3洗3 min。滴加50加n性過氧化物抗體（1:100），37℃濕盒中孵育90 min，PBS充分浸洗3 min。滴加SupervisionTM鼠/兔通用二抗檢測(cè)系統(tǒng)室溫孵育25 min，PBS充分浸洗3 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察和分析。選用已知陽(yáng)性的乳腺癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 RCAS1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為細(xì)胞漿或膜著色，呈棕黃色。每例切片隨機(jī)選取至少5個(gè)高倍視野（×高倍視野），計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞，評(píng)分參照免疫反應(yīng)積分法。染色強(qiáng)度分為4級(jí)：不顯色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率分為4級(jí)，陰性為0分，≤25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。兩分級(jí)相加，0～3分為陰性表達(dá)，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RCAS1蛋白表達(dá)情況 RCAS1陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞為細(xì)胞漿或膜著色，呈棕黃色。RCAS1在乳腺癌組織、癌旁組織的表達(dá)率分別為84%（88/105）、17%（18/105），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RCAS1蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織表達(dá)情況Table 1 Expression of RCAS1 protein in breast cancer tissue and paracancerous tissue

2.2 RCAS1蛋白的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系 在乳腺癌組織中，RCAS1蛋白的表達(dá)在以患者的年齡、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 RCAS1蛋白的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系Table 2 Relationship between expression of RCAS1 protein and clinicopathological features of breast cancer

3 討論

腫瘤細(xì)胞為實(shí)現(xiàn)其對(duì)宿主的免疫逃逸，主要通過修飾腫瘤細(xì)胞本身和改變腫瘤微環(huán)境以逃逸宿主免疫細(xì)胞的識(shí)別和攻擊。而腫瘤一旦發(fā)生其細(xì)胞的自身特點(diǎn)就決定其逃逸能力。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞以及細(xì)胞因子等組成，是機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行博弈的場(chǎng)所，因而，腫瘤微環(huán)境上的機(jī)體免疫細(xì)胞識(shí)別與攻擊腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)弱在很大程度上決定了腫瘤細(xì)胞能否成功實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。

人RCAS1/EBAG9基因即SiSo細(xì)胞上/雌激素受體結(jié)合片段相關(guān)基因9表達(dá)的受體結(jié)合腫瘤抗原，定位于人類染色體8q23.2，是一種雌激素轉(zhuǎn)錄蛋白。RCAS1蛋白是通過其C末端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)形成同型寡聚體的Ⅱ型膜蛋白，在多種人類癌細(xì)胞上有表達(dá)，如子宮、卵巢、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌細(xì)胞等。研究表明，RCAS1蛋白作為存在于各種人類細(xì)胞中的推定受體的配體，包括正常的外周淋巴細(xì)胞，如T，B和天然殺傷（NK）細(xì)胞，不僅存在于腫瘤細(xì)胞中，而且還存在于正常組織的細(xì)胞中，并且控制免疫應(yīng)答。在體外和體內(nèi)RCAS1蛋白抑制受體表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過caspase-3的活化和線粒體跨膜電位的崩解誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞死亡，RCAS1蛋白可能通過抑制T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)又促進(jìn)其凋亡而在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮作用，如RCAS1誘導(dǎo)活化的TILs凋亡而使腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫監(jiān)視。RCAS1蛋白的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和多種癌癥患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[4-8]。

本文采用免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)RCAS1蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)率分別為84%（88/105）、17%（18/105），與Suzuki T等在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，用免疫組化等方法研究發(fā)現(xiàn)RCAS1表達(dá)陽(yáng)性率為90.1%（82/91）相似[9]。乳腺癌組織與癌旁組織中RCAS1蛋白的表達(dá)有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中，RCAS1蛋白的表達(dá)在以病人的年齡、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面作為比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RCAS1基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，癌旁組織中呈低表達(dá)，而這種高表達(dá)在以年齡、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等方面作為比較的癌組織中表達(dá)沒有差異，提示RCAS1基因表達(dá)可能與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)，與年齡、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面關(guān)系不密切，這可能是RCAS1蛋白可能通過抑制T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)又促進(jìn)其凋亡而在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮作用有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，RCAS1蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境及其免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[10]。

本文采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)105例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織及相應(yīng)癌旁組織的RCAS1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RCAS1基因與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌密切相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。