肝細(xì)胞癌中SETDB1的表達(dá)及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，四川 瀘州 646099）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是我國(guó)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1-2]。編碼基因位于人類染色體1q21上的SET結(jié)構(gòu)域分支型1（SET domain bifurcated 1, SETDB1）是一種組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶[3-5]。有研究顯示，前列腺癌及非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的SETDB1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲具有促進(jìn)作用，并且能對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)[6-7]。本研究檢測(cè)HCC中SETDB1的表達(dá)，通過敲除SETDB1研究其對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖凋亡能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選取2014年1月-2016年3月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的50例HCC患者的組織標(biāo)本及35例因肝外傷或肝血管瘤而切除患者的正常肝組織標(biāo)本。所有標(biāo)本于離體30 min內(nèi)取材，于中性甲醛溶液中保存、固定。

1.1.2 細(xì)胞來(lái)源及主要試劑 肝癌MHCC97H細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，并由本科實(shí)驗(yàn)室保存。SETDB1特異性shRNA慢病毒顆粒（病毒載體類型：psi-LVRH1GP）購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司，DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC/PI雙染法,E606336）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，Trizol試 劑（15596026）、RT-PCR試劑盒（SuperScript?One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase, 10928042） 及qPCR試劑盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗人SETDB1單克隆抗體（#2196）、兔抗人組蛋白H3單克隆抗體（#9717）、兔抗人H3K9me3單克隆抗體（#13969）、兔抗人p53單克隆抗體（#2527）及兔抗人β-actin單克隆抗體（#4970）購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋的標(biāo)本組織切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟及水化預(yù)處理；用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人SETDB1多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標(biāo)本。4℃恒溫冰箱內(nèi)孵育過夜，洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，DAB法顯示陽(yáng)性蛋白。每張組織切片在400倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行閱片。＞10%癌細(xì)胞胞核呈棕黃色或棕褐色染色即為陽(yáng)性，否則判定為陰性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染

MHCC97H細(xì)胞于適宜環(huán)境中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳2代或3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將MHCC97H細(xì)胞按過夜增殖至愈合度達(dá)70%的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）充分洗滌細(xì)胞。慢病毒感染分組：每孔加入1 ml sh-SETDB1慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15μg Ploybrene作為sh-SETDB1組；每孔加入1 ml sh-Control慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15μg Ploybrene作為sh-Control組。轉(zhuǎn)染48 h后，使用含2μg/ml Puromycin的完全培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.4 qRT-PCR

通過Trizol試劑提取標(biāo)本及細(xì)胞RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃預(yù)變性30 min，94℃變性2 min，循環(huán)1次后94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環(huán)40次后72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法計(jì)算SETDB1基因的相對(duì)含量。

1.5 Western blot檢測(cè)

采用RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋SETDB1、H3K9me3、p53及β-actin抗體。在4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察蛋白表達(dá)。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 平板克隆形成試驗(yàn)

將MHCC97H細(xì)胞按500個(gè)/孔均勻接種于6孔板中，更換完全培養(yǎng)基2次/周。培養(yǎng)2周后，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，1%結(jié)晶紫染色15 min，置于蒸餾水中洗去多余染液。風(fēng)干后將6孔板置于網(wǎng)格紙上統(tǒng)計(jì)每孔克隆形成數(shù)量，計(jì)算克隆形成率。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

將MHCC97-H細(xì)胞用預(yù)冷PBS工作液沖洗2次，胰酶消化細(xì)胞后1 500 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，預(yù)制緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml，將500μl細(xì)胞懸液與5μl Annexin V-FITC及10μl PI混合，室溫遮光反應(yīng)10 min后上機(jī)測(cè)試。

1.8 裸鼠皮下移植瘤模型的復(fù)制

6只5周齡BLAB/c裸鼠，隨機(jī)分為sh-SETDB1組和sh-Control組，每組3只，分組后各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sh-SETDB1和sh-Control細(xì)胞，以冷PBS溶液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞終濃度為2.0×107個(gè)/ml。使用1 ml注射器，將0.2 ml細(xì)胞懸液（約含4.0×106個(gè)細(xì)胞）接種于裸鼠背部近右下肢處皮下組織內(nèi)，復(fù)制裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠飼養(yǎng)4周，每周測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度及寬度，按（長(zhǎng)軸×短軸2）/2來(lái)計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SETDB1蛋白在HCC和正常肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，SETDB1位于細(xì)胞核。50例HCC組織中SETDB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為80.00%（40/50），35例正常肝組織中SETDB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為31.43%（11/35），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.238，P=0.000）。見圖1。

圖1 SETDB1在HCC和正常肝組織中的表達(dá)

2.2 不同影響因素下的SETDB1陽(yáng)性表達(dá)

HCC組織中不同直徑腫瘤比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SETDB1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤體積增大關(guān)系密切。見表1。

表1 不同影響因素下的SETDB1陽(yáng)性表達(dá)率比較

2.3 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖、凋亡的影響

sh-Control組SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.00），sh-SETDB1組 為（0.38±0.11）， 經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.219，P=0.017）。sh-Control組SETDB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.46±0.08），sh-SETDB1組為（0.17±0.02），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.071，P=0.036）。sh-SETDB1組抑制MHCC97H細(xì)胞克隆率為（81.34±10.29）%，sh-Control組為（53.22±8.31）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義（t=4.025，P=0.029）。sh-SETDB1組 促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡率為（31.45±6.19）%，sh-Control組為（18.08±5.33）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.740，P=0.031）。見圖 2。

圖2 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.4 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

sh-SETDB1組MHCC97H細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度為（0.010±0.004）cm3/d，sh-Control組為（0.050±0.010）cm3/d，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.605，P=0.039）。飼養(yǎng)4周后處死動(dòng)物獲取皮下腫瘤，sh-SETDB1組最終腫瘤體積為（1.34±0.31）cm3，sh-Control組為（0.41±0.12）cm3，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.581，P=0.031）。見圖3。

2.5 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞中H3K9me3和p53表達(dá)的影響

sh-Control組MHCC97H細(xì)胞中H3K9me3的表達(dá)水平為（0.73±0.09），sh-SETDB1組為（0.13±0.02），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.427，P=0.025）sh-Control組 p53的表達(dá)水平為（0.67±0.06），sh-SETDB1組 為（0.21±0.04）， 經(jīng)t檢 驗(yàn)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.060，P=0.041），sh-Control組H3的表達(dá)水平為（0.42±0.03），sh-SETDB1組為（0.39±0.02），兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.036，P=0.205）。SETDB1并未調(diào)控組蛋白H3的表達(dá)，而是通過調(diào)控組蛋白H3甲基化抑制p53的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。見圖4。

圖3 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響

圖4 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞內(nèi)H3K9me3和p53表達(dá)的影響

3 討論

SETDB1作為一種蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明其能與異染色質(zhì)蛋白1及其共抑制子KAP1在異染色質(zhì)中結(jié)合而促進(jìn)H3K9me3形成[8-9]。本研究的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，50例HCC組織中SETDB1的陽(yáng)性表達(dá)率要高于35例正常肝組織，并且高表達(dá)SETDB1的患者腫瘤體積增大。說(shuō)明在臨床上檢測(cè)肝癌組織中SETDB1的表達(dá)對(duì)判斷患者腫瘤進(jìn)展有一定參考價(jià)值。

目前，雖然在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了SETDB1的異常表達(dá)，但是其具體的生物學(xué)功能尚不完全清楚[10]。在非小細(xì)胞肺癌中，SETDB1通過正向激活WNT-βcatenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，相似的生物學(xué)作用也存在于腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中[11-12]。但是WU等[13]的研究結(jié)果卻指出，SETDB1能與SMAD2和SMAD3形成SETDB1/SMAD2/3抑制性復(fù)合體來(lái)抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在本研究中，筆者通過細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)表明，體外沉默SETDB1的表達(dá)致使肝癌MHCC97H細(xì)胞的增殖能力受到抑制。除此之外，動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)模型也指明，下調(diào)SETDB1的表達(dá)能夠抑制MHCC97H細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)。綜合上述結(jié)果表明，下調(diào)SETDB1的表達(dá)是抑制肝癌生長(zhǎng)的有效手段之一。SETDB1能夠特異性甲基化組蛋白H3的K9位點(diǎn)，形成甲基化的組蛋白H3K9me3。有研究指出，H3K9me3的形成與包括p53在內(nèi)的許多抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因失活有關(guān)[14]。在本研究中，筆者在沉默SETDB1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)H3K9me3的表達(dá)水平降低，而p53的表達(dá)水平升高，提示SETDB1促腫瘤生長(zhǎng)可能與抑制p53的表達(dá)有關(guān)。另外，p53在肺癌中還可能作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合在SETDB1的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄過程[15]。說(shuō)明p53與SETDB1存在復(fù)雜的相互制約關(guān)系。在HCC中p53的失活是一種普遍現(xiàn)象，這也部分揭示了SETDB1在HCC中高表達(dá)的原因[16]。

綜上所述，SETDB1是HCC中高表達(dá)的促癌分子，沉默SETDB1的表達(dá)可能通過恢復(fù)p53的表達(dá)而抑制HCC增殖并促進(jìn)其凋亡。