NLR、FIB和Pgp1評估結(jié)直腸癌預(yù)后的價值

（陜西省寶雞市中心醫(yī)院 肛腸外科，陜西 寶雞 721008）

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[1-3]。目前臨床上對結(jié)直腸癌患者的預(yù)評估主要是TNM分期[4-5]。但是TNM分期無法滿足個體化治療的要求。目前，臨床上正著力研究可以有效評估結(jié)直腸癌預(yù)后的檢測手段。本研究擬綜合檢測患者中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophillymphocyte ratio, NLR）、纖維蛋白原（Fibrinogen,FIB）和P-糖蛋白1（P-glycoprotein 1, Pgp1）在癌組織的表達。以早期發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)風(fēng)險的結(jié)直腸癌患者，從而制定精準(zhǔn)有效的治療方案，提高患者的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2012年5月于陜西省寶雞市中心醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)的223例患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性結(jié)直腸癌且行根治性切除術(shù)；②簽署留取病理標(biāo)本同意書，病理組織保存完整；③由AJCC第7版腫瘤分期指南診斷的Ⅰ期或Ⅱ期的結(jié)直腸癌[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①于本院治療前進行過放化療；②行根治術(shù)時合并其他腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 于患者手術(shù)前后整理并記錄完整臨床資料，包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、病理學(xué)類型、腫瘤位置、TNM分期、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，有無術(shù)前腸梗阻、術(shù)后并發(fā)癥等。

1.2.2 NLR水平的測定 于次日清晨采集所有患者術(shù)前外周血，囑患者采血前8 h內(nèi)不要喝水進食。以患者肘正中靜脈為穿刺點，穿刺部位2次消毒后，抽取5 ml血液于血常規(guī)專用紫色真空采血管中，反復(fù)顛倒混勻。標(biāo)記患者姓名、性別、住院號、采血時間、采血用途及采血人姓名等送檢。使用HF-3800血液細胞分析儀（山東海力孚公司）分析患者血液樣本，記錄中性粒細胞計數(shù)（Neutrophil, N）、淋巴細胞計數(shù)（Lymphocyte, L），計算兩者比值：NLR=N/L。

1.2.3 FIB水平的測定 于次日清晨采集所有患者術(shù)前外周血，囑患者采血前8 h內(nèi)不要喝水進食。以患者肘正中靜脈為穿刺點，穿刺部位2次消毒后，抽取5 ml血液于凝血四項專用藍色真空采血管中，反復(fù)顛倒混勻。注意采血時間盡量≤5 min，采血帶不要扎的太緊，以防激活凝血機制。操作過程中避免產(chǎn)生氣泡，以防FIB變性。標(biāo)記患者姓名、性別、住院號、采血時間、采血用途及采血人姓名等送檢。使用Clauss法分析患者血液樣本，獲得凝血四項報告單，記錄FIB的數(shù)值。

1.2.4 腫瘤組織Pgp1表達水平的測定和評分 采用SP法進行免疫組織化學(xué)，一抗為兔抗人Pgp1多克隆抗體，二抗為加入生物素標(biāo)記的羊抗兔工作液。4%中性甲醛固定病理標(biāo)本，脫水后石蠟包埋。①以4μm厚進行連續(xù)切片，常規(guī)烤片及二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，PBS沖洗5 min×4次；②3%H2O2室溫避光孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS沖洗5 min×4次；③用檸檬酸抗原修復(fù)液進行熱抗原修復(fù)；④山羊血清工作液室溫下封閉10 min后棄去工作液勿洗；⑤將兔抗人Pgp1多克隆抗體分別加入同一患者的幾張切片并置于4℃冰箱孵育過夜，次日37℃復(fù)溫40 min后PBS沖洗5 min×4次；⑥加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×4次；⑦二氨基聯(lián)苯胺顯色，流水沖洗15 min后蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥及封片，最后于光鏡下觀察并拍照。

由1位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生觀察所有切片，每張切片隨機觀察10個高倍鏡視野，根據(jù)染色結(jié)果進行評分：0分為＜5%；1分為≥5%～＜25%；2分為≥25%～＜50%；3分為≥50%～＜75%；4分為≥75%。染色強度評分：不顯色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；深棕色3分。每張切片分值=染色細胞數(shù)分值×染色強度分值。若每張切片分值＜1分，則判斷免疫組織化學(xué)結(jié)果陰性（-）；若為1～3分，則為弱陽性（+）；若為4～5分，則為中度陽性（++）；若＞5分，則為強陽性（+++）。定義Pgp1表達中度陽性（++）和強陽性（+++）為高表達，陰性（-）和弱陽性（+）為低表達。

1.3 隨訪及觀察指標(biāo)

對所有參與研究的223例患者進行為期5年的隨訪，首次隨訪為治療結(jié)束1個月后，之后每隔1個月電話隨訪1次。終點事件為：患者自入選時間起于隨訪期間發(fā)生不良預(yù)后事件，包括患者結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、分期上升及出現(xiàn)其他器官轉(zhuǎn)移。原始資料參照患者入院記錄、手術(shù)記錄及麻醉記錄，并將末次隨訪記錄作為結(jié)果，記錄患者發(fā)生不良預(yù)后的人數(shù)并定義為預(yù)后不良組，其余患者定義為預(yù)后良好組?；颊呔芙^訪問、中途退出及死于其他與研究無關(guān)的原因定義為失訪。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料以率（%）表示，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，單因素Cox回歸分析篩選變量，預(yù)后影響因素的分析采用多因素Cox回歸模型。繪制ROC曲線，利用Kolmogorov-Smirnov檢驗比較不同指標(biāo)評估結(jié)直腸癌預(yù)后的準(zhǔn)確性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

223例患者腫瘤直徑平均（4.32±0.56）cm；TNM分期Ⅰ期46例，Ⅱ期177例；平均淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10.46個；脈管癌栓陰性169例，陽性54例；腺癌101例，黏液腺癌122例；術(shù)前腸梗阻患者89例，無術(shù)前腸梗阻患者134例；術(shù)后并發(fā)癥患者50例，無術(shù)后并發(fā)癥患者173例；Pgp1高表達149例，低表達74例；高NLR值123例，低NLR值100例；高FIB值98例，低FIB值125例。

2.2 患者隨訪情況

在隨訪結(jié)束時，失訪患者共11例，124例患者隨訪結(jié)束未發(fā)生終點事件，5年生存率為58.49%（124/212）,定義為預(yù)后良好組，78例患者出現(xiàn)了終點事件，定義為預(yù)后不良組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，隨著時間延長，全體患者不良預(yù)后增多，在隨訪的第20、40個月產(chǎn)生不良預(yù)后的患者增長較為明顯。見圖1。

圖1 患者不良預(yù)后生存曲線圖

2.3 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析

將可能影響疾病預(yù)后的因素（年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、病理類型、術(shù)前腸梗阻、術(shù)后并發(fā)癥、腫瘤組織Pgp1表達、NLR及FIB水平）逐個納入Cox比例風(fēng)險模型中進行單因素分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤部位、TNM分期對疾病預(yù)后無影響（P＞0.05），患者年齡、性別、病理類型、術(shù)前腸梗阻、術(shù)后并發(fā)癥、Pgp1、NLR、FIB水平對疾病預(yù)后影響顯著（P=0.027、0.003、0.035、0.021、0.013、0.025、0.012和 0.005）。

2.4 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

篩選單因素Cox回歸差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素進行多因素Cox回歸分析（引入水準(zhǔn)0.05，剔除水準(zhǔn)0.10）。結(jié)果顯示：年齡和性別對患者預(yù)后的影響不明顯（P＞0.05）；病理類型、術(shù)前腸梗阻、術(shù)后并發(fā)癥、Pgp1、NLR及FIB是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立影響因素（P＜0.05）。見附表。

2.5 Pgp1的結(jié)直腸癌預(yù)后分析

將Pgp1表達作為結(jié)直腸癌術(shù)后預(yù)后的指標(biāo)，Pgp1在結(jié)直腸癌患者預(yù)后的敏感性和特異性分別為60.23%（53/88）和 70.16%（87/124）。

2.6 NLR和FIB單獨及聯(lián)合診斷對結(jié)直腸癌預(yù)后轉(zhuǎn)歸的評估價值分析

NLR診斷結(jié)直腸癌預(yù)后的AUC為0.801，最佳診斷點為4.15 ng/ml，其敏感性為62%，特異性為92%；FIB的AUC為0.678，低于NLR，最佳診斷點為594.82 ng/ml，其敏感性為36%，特異性為99%。NLR和FIB兩者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌預(yù)后的AUC最高，為0.856，其敏感性為78%，特異性為79%。兩者聯(lián)合預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的AUC與NLR和FIB比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=4.939和2.591，P=0.000和0.009）。見圖2。

附表 患者不良預(yù)后的Cox多因素分析

圖2 NLR和FIB單獨及聯(lián)合診斷對結(jié)直腸癌預(yù)后的ROC曲線

3 討論

結(jié)直腸癌在我國的5年生存率為32.8%～61.4%[7-8]。因此其預(yù)后的研究一直是近年的熱點。目前臨床上主要通過病理分型、TNM分期等評估預(yù)后[9-10]。然而疾病的演變隨著個體及環(huán)境的影響愈發(fā)復(fù)雜，本研究將NLR、FIB水平和癌組織Pgp1的表達進行綜合分析，以提高預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的準(zhǔn)確性。

本研究的5年生存率為58.49%，與KENNEDY等研究結(jié)果基本一致[7]。筆者認為可能是由于本研究納入的患者平均年齡高，大部分合并有其他非腫瘤性的慢性疾病，或由于結(jié)直腸癌患者本身的危險因素較多，對預(yù)后產(chǎn)生了不良影響。目前越來越多的研究提示血液學(xué)指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo)與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[11-12]。本研究中病理類型、FIB、NLR、Pgp1、術(shù)后并發(fā)癥及術(shù)前腸梗阻依次為結(jié)直腸癌的預(yù)后影響因子。血液學(xué)指標(biāo)FIB、NLR和免疫學(xué)指標(biāo)Pgp1會影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后，可能因為：一方面纖維蛋白原FIB升高預(yù)示著由纖維蛋白構(gòu)成的腫瘤細胞骨架被破壞，癌細胞發(fā)生了浸潤與轉(zhuǎn)移，與大部分發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)凝血系統(tǒng)異常相符[13]。NLR升高標(biāo)志著腫瘤增殖旺盛但體內(nèi)免疫防衛(wèi)機制處于被抑制的狀態(tài)，預(yù)示著預(yù)后較差[14]。另一方面，近年來，一些免疫學(xué)指標(biāo)細胞膜跨膜糖蛋白Pgp1可主動泵出對正常細胞來說的異物[15-16]。當(dāng)其高表達時，可限制癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移，提示患者預(yù)后良好。

為進一步探究NLR、FIB和Pgp1對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響，患者對其進行ROC曲線分析。結(jié)果顯示，聯(lián)合NLR和FIB評估患者預(yù)后的敏感性可達78%，較3者單獨預(yù)測時均有提高?？赡苁且驗镹LR和FIB分別從機體免疫狀態(tài)與凝血功能水平方面客觀反映腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移情況，并且雙指標(biāo)的聯(lián)合評估在一定程度上減少了血清、組織及機體反應(yīng)等方面?zhèn)€體差異對預(yù)測結(jié)果的影響，提高了預(yù)測準(zhǔn)確性。

本研究納入的樣本量較少，且Pgp1為定性指標(biāo)，相比計量指標(biāo)其準(zhǔn)確性有所偏差。建議將來的研究者選擇更多計量資料進行分析，并分別定義年輕患者和老年患者群體各項危險因素指標(biāo)的臨界值，以提高其預(yù)后的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究表明Pgp1、NLR及FIB是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素，NLR和FIB聯(lián)合檢測可提高預(yù)后的特異性，協(xié)助臨床篩選具有預(yù)后不良風(fēng)險的患者，從而制定高效的治療方案。