利拉魯肽調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的機(jī)制探討*

郭皓宇，曾亞，申月明，王俊，侯周華

（1.湖南省長沙市中心醫(yī)院 消化科，湖南 長沙 410004；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 感染病科，湖南 長沙 410008）

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）是腸道L細(xì)胞分泌的激素[1]。人類的GLP-1受體在第6號染色體[2]。GLP-1可通過抑制胰高血糖素分泌、延緩胃排空等作用調(diào)控血糖[3]。GLP-1受體激動(dòng)劑通過SIRT1改善小鼠非酒精性脂肪肝[4]。利拉魯肽是臨床一線藥[5]，其調(diào)節(jié)脂肪肝作用仍未明確。

在表達(dá)GLP-1的ob/ob小鼠中，脂肪酸合酶（fatty acid synthase, FAS）表達(dá)降低，說明GLP-1能調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)沉積[6]。其他研究顯示，脂肪肝模型中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c, SREBP-1c）被激活，提示SREBP-1c是脂肪肝的主要調(diào)控因素[7]。

本研究通過利拉魯肽干預(yù)2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）大鼠，探討其對T2DM大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性SD大鼠，7～8周齡，體重180～200 g，購自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.1.2 主要試劑及儀器 高脂飼料（脂肪60%）（美國Research Diets公司），利拉魯肽注射液[北京諾和諾德（中國）制藥有限公司]，血清脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（美國RayBiotech公司），腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase, AMPK）抗體、磷酸化的AMP激活的蛋白激酶（Thr172p-AMPK）抗體、β-actin（13E5）抗體購自美國CST公司，膽固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白1（sterolregulatory element binding proteins 1, SREBP1）抗體（英國Abcam公司），鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）、油紅O染色試劑購自美國Sigma公司，Optium血糖檢測試紙（美國雅培公司），正立顯微成像系統(tǒng)BX51WI（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的復(fù)制及干預(yù) 30只雄性SD大鼠在（22±2）℃、濕度50%、12 h晝/夜循環(huán)照明的潔凈環(huán)境中，以干燥玉米碎末為墊料，5只/籠，自由取水和飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。根據(jù)體重隨機(jī)抽取20只SD大鼠復(fù)制T2DM模型：高脂飼料（脂肪60%）喂養(yǎng)5周，隨后腹腔注射STZ（35 mg/kg體重），3 d后經(jīng)尾靜脈取血測量空腹血糖?？崭寡牵?3.8 mmol/L即T2DM大鼠模型復(fù)制成功[8-9]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將T2DM大鼠模型隨機(jī)分為兩組，每組10只。糖尿病組大鼠維持高脂喂養(yǎng)，不干預(yù)；利拉魯肽組大鼠維持高脂喂養(yǎng)，并通過腹腔注射利拉魯肽（0.225μg/g體重），2次/d[10]。剩余10只大鼠以普通飼料（脂肪10%）常規(guī)喂養(yǎng)，作為對照組。以利拉魯肽治療后8周作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前取全血并分離血清，處死動(dòng)物后立刻切取肝臟標(biāo)本，置于液氮罐中快速冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 臨床指標(biāo) 監(jiān)測血糖時(shí)大鼠禁食8 h。采用Optium血糖檢測試紙檢測大鼠空腹血糖。在室溫下將1滴血液標(biāo)本滴于試紙樣品槽，血糖監(jiān)測儀自動(dòng)讀出血糖濃度，每個(gè)標(biāo)本檢測3次[4]。收集動(dòng)物標(biāo)本后，用離心法從全血中分離出血清，用酶法檢測血清中三酰甘油和總膽固醇的含量，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測量3次。所有檢測方法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 肝組織冷凍切片油紅O染色 將獲取的新鮮肝組織浸泡于液氮中快速冷卻，隨后轉(zhuǎn)移至冷凍切片機(jī)中進(jìn)行冷凍切片，厚度約8μm。將冷凍切片用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定10 min，再以PBS洗滌3次。將已固定的切片浸泡于0.5%油紅O染液10～15 min后，轉(zhuǎn)移至60%酒精中，分化切片至間質(zhì)清晰。采用蘇木精染液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染1～2 min。將切片在流動(dòng)雙蒸水中沖洗后以中性樹膠封片。將油紅O染色肝臟切片置于光學(xué)顯微鏡下，觀察肝組織的脂肪沉積情況[4]。

1.2.5 血清脂聯(lián)素水平檢測 采用脂聯(lián)素ELISA試劑盒檢測血清脂聯(lián)素水平。在預(yù)鋪脂聯(lián)素一抗的96孔板中加入大鼠的血清樣品和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，37℃條件下孵育后洗滌，加入鏈接辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素二抗，孵育后再次洗滌。加入四甲基聯(lián)苯胺底物，室溫下顯色1 min后加入硫酸終止顯色反應(yīng)。立即在酶標(biāo)儀中測量各孔450 nm波長處的吸光度，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各血清標(biāo)本中脂聯(lián)素水平。

1.2.6 Western blot檢測 采用Western blot檢測肝組織中Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白的表達(dá)水平。在冷浴條件下用勻漿器對肝臟進(jìn)行勻漿分散。在每個(gè)標(biāo)本的分散液中加入裂解液，提取標(biāo)本的總蛋白和核蛋白。以BCA法建立蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線后，定量計(jì)算各肝臟標(biāo)本中的總蛋白和蛋白濃度。由于Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c及β-actin蛋白分子量差異明顯，室溫下分別用7%和10% SDSPAGE膠對蛋白電泳分離1.0～1.5 h，在冷浴條件下轉(zhuǎn)膜45 min。用5%脫脂奶粉溶液完全浸泡PVDF膜，室溫下封閉2 h。分別將膜在相應(yīng)的抗體中進(jìn)行孵育，4℃條件下孵育過夜。次日將膜洗滌3次后，加入熒光二抗在室溫下避光孵育，洗滌后在多功能成像儀暗室中曝光、成像、記錄圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臨床指標(biāo)比較

2.1.1 體重 3組大鼠體重比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對照組比較，糖尿病組大鼠體重增加（P＜0.05）；與糖尿病組比較，利拉魯肽降低了大鼠的體重（P＜0.05）。見表 1。

2.1.2 空腹血糖 3組大鼠空腹血糖比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對照組比較，糖尿病組大鼠空腹血糖升高（P＜0.05）；與糖尿病組比較，利拉魯肽降低了大鼠的空腹血糖（P＜0.05）。見表1。

2.1.3 三酰甘油 3組大鼠血清三酰甘油水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對照組比較，糖尿病組大鼠三酰甘油水平升高（P＜0.05）；與糖尿病組比較，利拉魯肽降低了大鼠的三酰甘油水平（P＜0.05）。見表1。

2.1.4 總膽固醇 3組大鼠血清總膽固醇水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠臨床指標(biāo)比較 （n =10，±s）

表1 各組大鼠臨床指標(biāo)比較 （n =10，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與糖尿病組比較，P ＜0.05

組別 體重/g 空腹血糖/（mmol/L） 三酰甘油/（mmol/L） 總膽固醇/（mmol/L）對照組 375.12±6.312 4.910±0.301 0.594±0.093 7.544±1.982糖尿病組 419.42±8.1111） 18.042±0.4921） 2.022±0.0641） 9.869±2.321利拉魯肽組 336.33±12.1232） 8.030±0.3612） 0.613±0.0712） 7.348±3.033 F值 2.749 5.448 6.749 0.774 P值 0.047 0.002 0.002 0.538

2.2 利拉魯肽減輕T2DM大鼠的脂質(zhì)沉積

肝臟冷凍切片油紅O染色可見對照組大鼠肝臟中幾乎無脂肪沉積，而糖尿病組T2DM大鼠肝臟中可見大量的脂肪滴沉積。T2DM大鼠經(jīng)利拉魯肽治療后，肝臟組織也可見脂質(zhì)沉積，但其沉積程度低于糖尿病組。見圖1。

圖1 各組大鼠脂質(zhì)沉積情況 （油紅O染色×20）

2.3 利拉魯肽對血清脂聯(lián)素的影響

對照組、糖尿病組、利拉魯肽組大鼠血清脂聯(lián)素水平分別為（49.84±3.56）、（16.84±1.45）和（86.55±4.44）ng/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.128，P=0.004）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對照組比較，糖尿病組大鼠血清脂聯(lián)素水平降低61.51%（t=5.448，P=0.044）；經(jīng)利拉魯肽治療后大鼠血清脂聯(lián)素水平較糖尿病組升高4.61倍（t=6.512，P=0.0043）。

2.4 利拉魯肽對大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白表達(dá)的影響

3組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，糖尿病組大鼠肝臟AMPK和Thr172p-AMPK蛋白表達(dá)水平較對照組降低（P＜0.05），而SREBP-1c蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；利拉魯肽干預(yù)治療后，利拉魯肽組大鼠肝臟Thr172p-AMPK和AMPK蛋白相對表達(dá)量回升（P＜0.05），同時(shí)SREBP-1c蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 各組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白表達(dá)水平比較 （n =10，±s）

表2 各組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白表達(dá)水平比較 （n =10，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與糖尿病組比較，P ＜0.05

組別 Thr172p-AMPK AMPK SREBP-1c對照組 1.15±0.46 3.18±1.11 0.594±0.12糖尿病組 0.99±0.231） 1.75±0.541） 4.11±0.981）利拉魯肽組 3.98±0.992） 2.93±0.882） 0.613±0.112）F值 2.881 4.452 7.113 P值 0.038 0.015 0.015

圖2 各組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白的表達(dá)

3 討論

GLP-1是一種葡萄糖依賴性腸促胰素。大量研究結(jié)果顯示，其對T2DM、代謝綜合征及非酒精性脂肪肝有明顯的改善作用[4，10-12]。GLP-1受體激動(dòng)劑可顯著降低糖尿病患者體重、空腹血糖，糖化血紅蛋白水平[13]，促進(jìn)β細(xì)胞增殖，抵制細(xì)胞凋亡[14]。作為GLP-1受體激動(dòng)劑的利拉魯肽，已廣泛應(yīng)用于T2DM的降糖治療中。研究顯示，利拉魯肽具有改善胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝紊亂作用[15-16]，但其對減輕肝臟脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制缺乏統(tǒng)一觀點(diǎn)[17]，目前主要認(rèn)為其可能通過脂肪酸合成過程影響肝臟脂質(zhì)平衡，改善肝臟的脂肪過度沉積。

本研究采用高脂飲食和STZ誘導(dǎo)復(fù)制T2DM大鼠模型，糖尿病組大鼠血糖和血脂水平較對照組升高，提示糖尿病組大鼠存在糖脂代謝異常，經(jīng)利拉魯肽治療后，血糖和血脂均明顯恢復(fù)，證實(shí)利拉魯肽改善大鼠糖脂代謝的作用。此外，通過大鼠肝臟組織油紅O染色結(jié)果顯示，利拉魯肽可同時(shí)減輕T2DM大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，脂聯(lián)素與肝臟的胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)，通過與其受體結(jié)合激活A(yù)MPK，從而加速細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝[7]。T2DM個(gè)體中脂聯(lián)素明顯降低，表明脂聯(lián)素可能是T2DM個(gè)體肝臟脂肪過度沉積的關(guān)鍵因子，但其相關(guān)機(jī)制尚未明確。因此本研究對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，推測利拉魯肽在T2DM大鼠中上調(diào)脂聯(lián)素，一方面通過激活Thr172p-AMPK、AMPK加速脂質(zhì)代謝[18]；另一方面通過下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)，減少脂肪酸的合成，從而減少T2DM的肝臟脂質(zhì)沉積。本研究結(jié)果顯示，利拉魯肽能提高T2DM大鼠血清的脂聯(lián)素水平，提示利拉魯肽可能通過脂聯(lián)素通路改善肝臟的脂質(zhì)代謝。本研究中Western blot檢測結(jié)果與血清檢測結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，利拉魯肽通過激活脂聯(lián)素-AMPK通路，抑制SREBP-1c的表達(dá)，減輕T2DM大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積。

然而，GLP-1受體激動(dòng)劑調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝的過程是多通路、多方面的，GLP-1受體激動(dòng)劑也可能通過激活MAPK通路，促進(jìn)脂肪酸氧化，逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞脂肪變性[19-20]。近期有體外研究顯示，在LO2細(xì)胞中，利拉魯肽能夠通過增加細(xì)胞自噬作用，從而減少肝臟的脂肪沉積[21]。

GLP-1受體激動(dòng)劑能夠改善患者的脂肪沉積的報(bào)道越來越多[22-23]，且主要通過2個(gè)途徑：①抑制脂肪合成和沉積；②刺激脂肪酸氧化來改善肝臟的脂質(zhì)沉積，但具體機(jī)制并未完全闡述明晰。作為GLP-1類似物的利拉魯肽，在T2DM及其并發(fā)癥的治療方面具有非常好的前景，且目前利拉魯肽已經(jīng)是減輕體重的一線用藥，但其分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。

雖然利拉魯肽可通過抑制脂質(zhì)合成來改善T2DM大鼠的非酒精性脂肪肝，但是利拉魯肽是否可以通過刺激脂肪酸氧化或加強(qiáng)肝臟脂質(zhì)動(dòng)員來發(fā)揮作用，是本研究后續(xù)要探討的問題。