藜麥種子不同溶劑提取物及其抗氧化活性

華艷宏， 龐春花，， 張永清， 賀 笑， 楊世芳， 薛 蓉

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041004； 2.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院生物系，山西臨汾 041000)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)別稱南美藜，是藜科(Chenopodiaceae)藜屬(Chenopodium)的1年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲的安地斯山脈，是當(dāng)?shù)氐囊环N農(nóng)作物，有幾千年的種植歷史[1]。目前在我國西藏、山西及西北地區(qū)都有種植。21世紀(jì)以來，藜麥在全球范圍開始引種和試種，成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。因其食品的安全性、全營養(yǎng)性，聯(lián)合國將2013年定義為國際藜麥年[2]。許多研究表明，藜麥蛋白質(zhì)含量高，氨基酸分配均衡，且脂肪酸多為不飽和脂肪酸，礦物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)含量豐富，是一種高蛋白、低熱量、活性物質(zhì)豐富的營養(yǎng)食物，可充分滿足人類生命活動的基本要求，不僅是健康食品，更是安全食品[3]，是具有腹腔疾病及過敏體質(zhì)人群的優(yōu)良食材[4]。多酚、黃酮是廣泛存在于植物中的活性物質(zhì)，因其具有抗氧化、抗衰老、預(yù)防心血管疾病并且能夠有效增強(qiáng)自身免疫力等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。研究已證實(shí)藜麥中含有豐富的多酚、黃酮類化合物，其中大部分是香草酚酸、阿魏酸及其衍生物、槲皮素、山奈酚[5-6]，表現(xiàn)出高抗氧化活性，是一種潛在的功能性食品。

目前，國內(nèi)外對藜麥種子和葉片中提取物的提取工藝和抗氧化活性的研究已有不少報道。陸敏佳等以藜麥葉片為原料，用乙醇作提取溶劑，研究藜麥葉片多酚、黃酮的最佳提取工藝及其抗氧化活性[7-8]。闕淼琳等以藜麥種子為原料，用乙醇作為提取溶劑，研究藜麥種子多酚的提取工藝及其品種差異[9]。董晶等以藜麥種子為原料，用乙醇作為提取溶劑，用超聲波法探討藜麥種子黃酮提取的最佳工藝并測定其抗氧化活性[10]。相啟森等以產(chǎn)自山西的白色藜麥為對象，研究其乙醇提取物的體外自由基清除能力、鐵離子還原能力及對自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化降解的抑制作用[11]。Tang等以甲醇為提取溶劑，確定了3種不同基因型(紅色、白色、黑色)藜麥中不同形式的酚類物質(zhì)，并且測定了其抗氧化活性[6]。上述研究主要以甲醇、乙醇等單一溶劑為提取溶劑對藜麥黃酮、多酚進(jìn)行提取，并未全面反映藜麥種子不同溶劑提取物的抗氧化活性。研究結(jié)果表明，由于提取溶劑的不同會導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定差異[12]。本試驗(yàn)以藜麥種子為研究材料，利用超聲波提取方法，探究以蒸餾水、甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇、丙酮、70%丙酮為提取溶劑對藜麥種子提取物的含量及其抗氧化活性的影響，旨在選出藜麥種子提取物超聲波提取時的最好溶劑，對優(yōu)化藜麥種子提取物的提取技術(shù)作進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試品種為一號藜麥種子，購自山西忻州億隆藜麥開發(fā)有限公司。

1.1.2 試劑 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、Folin-酚試劑、沒食子酸購自上海源葉生物科技有限公司；碳酸鈉、丙酮、甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子分析天平購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)購自天津市泰斯特儀器有限公司；KH-300B型超聲波清洗器購自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-75紫外可見分光光度計(jì)購自上海欣茂儀器有限公司；高速離心機(jī)購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋購自江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；RE-200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 對藜麥種子進(jìn)行除雜，挑選顆粒飽滿的種子進(jìn)行備用。準(zhǔn)確稱取100 g藜麥種子，用高速萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過60目篩子，冷藏備用。稱取藜麥粉末2 g置于燒杯中，分別加入50 mL蒸餾水、甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇、丙酮、70%丙酮進(jìn)行超聲提取。設(shè)定超聲溫度為50 ℃、超聲頻率為50 Hz、超聲時間為30 min和料液比(藜麥粉末質(zhì)量與浸提液的體積比，g/mL)為1 ∶25，超聲提取完畢冷卻，4 000 r/min 離心10 min，濾渣用同樣的方法再次提取，合并2次提取液，40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后用25 mL提取溶劑復(fù)溶得到待測樣液，低溫保存用于樣品分析測定。

1.2.2 總黃酮含量測定 移取5.0 mL提取液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min；然后加入 1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液4.0 mL，混勻，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇 0.4 mL，室溫下放置15 min后于波長為510 nm處測定其吸光度[13]，重復(fù)測定3次。以蒸餾水為空白，采用蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)為縱坐標(biāo)，吸光度(D)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到曲線回歸方程C=0.137 4D+0.000 9，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 2。不同提取物中總黃酮含量以1 g干燥樣品中所含的相當(dāng)于蕓香苷的含量進(jìn)行計(jì)算。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 總多酚含量測定 多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu比色法，參考Payet等的方法[14]并稍作修改。準(zhǔn)確移取藜麥提取液0.5 mL于10 mL的具塞比色試管中，分別加入 2.5 mL 蒸餾水，混合后加入0.5 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，混合，靜置8 min后，加入1.5 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用水定容至刻度線。密封室溫下避光放置2 h后，在波長為765 nm處測定吸光度D765 nm，重復(fù)測試3次，以溶劑代替樣品提取液為空白，調(diào)零，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的總酚濃度和總酚含量。

C總多酚=6.548 1D765 nm-0.032 7(r2=0.999 1)；

Y2=V×C總多酚/m×103。

式中：Y2為總多酚含量，mg/g；C總多酚為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的樣品中總多酚的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 DPPH清除能力測定 DPPH清除能力測定根據(jù)Locatelli等的方法[15]并稍作修改。準(zhǔn)確稱取DPPH 3.4 mg用無水乙醇溶解并定容于50.0 mL棕色容量瓶中得到 0.2 mmol/L 儲備液，冷藏備用。取2.0 mL待測液及2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液加入同一具塞試管中，并加入1.0 mL無水乙醇使反應(yīng)總體積達(dá)到5.0 mL，搖勻，在避光處反應(yīng) 30 min，在517 nm處測定其吸光度。

DPPH清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%。

式中：D0代表用無水乙醇代替藜麥種子提取液按上述方法測定的吸光度；D1代表加入待測液與DPPH溶液按上述方法測定的吸光度；D2代表用無水乙醇代替DPPH溶液按上述方法測定的吸光度。

1.2.5 羥基自由基清除能力的測定 采用水楊酸法[16]測定羥基自由基清除能力。取10 mL試管，向其中分別加入 6 mmol/mL 硫酸亞鐵溶液2 mL、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，再加入待測提取液1 mL(空白對照以蒸餾水代替提取液)，最后加入 6 mmol/L 過氧化氫溶液2 mL，搖勻，35 ℃水浴30 min，于510 nm波長處測其吸光度，由于樣液本身具有吸光度，測其本底值時用蒸餾水代替過氧化氫，根據(jù)公式計(jì)算其清除率。

清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%。

式中：D0為空白對照吸光度；D1為加入樣品溶液后的吸光度；D2為本底吸光度。

1.2.6 鐵還原能力測定 鐵還原能力測定采用Oyaizu的方法[17]并稍作修改。移取1.0 mL提取液加入10 mL具塞帶有刻度的試管中，再加入2.5 mL濃度為0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸緩沖液，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴條件下反應(yīng)20 min，取出迅速冷卻，立即加入10%三氯乙酸(TCA)溶液2.5 mL終止反應(yīng)，3 000 r/min 離心10 min，取離心后的上清液2.5 mL，加入 2.5 mL 蒸餾水，0.1% FeCl3溶液0.5 mL混勻，反應(yīng)10 min后于波長為700 nm處測定吸光度。以吸光度來表示還原能力的大小，吸光度越大，說明還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥種子不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量

由表1可知，用不同溶劑提取藜麥種子中的總多酚、總黃酮物質(zhì)，其含量均存在一定差異。不同溶劑提取液中總多酚含量為1.14～3.28 mg/g，其中以70%甲醇、70%乙醇為溶劑時提取物中的總多酚含量較高，分別為2.61、3.28 mg/g；其次總多酚含量由高到低依次為以70%丙酮、蒸餾水、乙醇、丙酮為溶劑時，含量最低的提取溶劑為甲醇，其總多酚含量為 1.14 mg/g。藜麥種子不同溶劑提取物中總黃酮含量為 1.34～1.98 mg/g，其中以蒸餾水、70%乙醇為溶劑時提取物中的總黃酮含量較高，分別為1.98、1.94 mg/g；其次由高到低順序?yàn)橐?0%丙酮、乙醇、丙酮、70%甲醇為溶劑時，總黃酮含量最低的是以甲醇為溶劑時的提取物，其含量為1.34 mg/g。

表1 不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。表2、表3、表4同。

2.2 不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮對DPPH的清除能力

由表2可知，不同溶劑提取物中，總多酚對DPPH清除能力為34.46%～90.25%，清除能力較高的是以70%甲醇、70%乙醇為溶劑時，分別為90.25%、90.13%，兩者間差異不顯著；較低的是以甲醇、乙醇、丙酮、蒸餾水為溶劑時，且它們之間差異不顯著。不同溶劑提取物中，總黃酮對DPPH的清除能力為 75.36%～87.34%，清除能力較高的是以蒸餾水、70%乙醇為溶劑時，分別為87.34%、87.15%，且兩者之間差異不顯著；清除能力較低的是以甲醇、丙酮為溶劑時，且兩者之間差異不顯著。

2.3 不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮對羥基自由基的清除能力

由表3可知，不同溶劑提取物總多酚對羥基自由基清除能力不同，清除能力較高的是以70%甲醇、70%乙醇為溶劑時，清除能力分別為75.08%、75.23%，且兩者之間差異不顯著；最低的是以蒸餾水為溶劑時，其清除能力為 17.15%。不同溶劑提取物總黃酮對羥基自由基的清除能力不同，不同溶劑間存在差異顯著性，以70%乙醇為溶劑時，清除能力最高，為55.26%；以甲醇為溶劑時，其羥基自由基清除能力最低，為47.82%。

表2 不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮的DPPH清除能力

表3 不同溶劑提取物總多酚、總黃酮對羥基自由基的清除能力

2.4 不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮的鐵還原能力

由表4可知，不同溶劑提取物中總多酚對鐵還原能力最高的是以70%甲醇為溶劑時，最低的是以丙酮為溶劑時，其中以甲醇、丙酮和蒸餾水為溶劑時，提取物中總多酚對鐵還原能力差異不顯著。不同溶劑提取物中總黃酮對鐵還原能力最高的是以70%丙酮為溶劑時，其次是以丙酮、70%乙醇為溶劑時，對鐵還原能力最低的是以蒸餾水為溶劑時，不同溶劑間總黃酮對鐵還原能力存在顯著差異。

表4 不同溶劑提取物中總多酚、黃酮鐵還原能力測定

2.5 不同溶劑提取物總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

由表5可知，相關(guān)系數(shù)的大小可反映不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，系數(shù)越大，相關(guān)性越強(qiáng)。不同溶劑提取物中總多酚含量與其DPPH清除能力、羥基自由基清除能力、鐵還原能力間存在顯著相關(guān)性，而總黃酮含量與其DPPH清除能力、羥基自由基清除能力、鐵還原能力間沒有顯著相關(guān)性。

表5 不同溶劑提取物總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性

注：*、**分別表示在0.05、0.01水平顯著相關(guān)。

3 討論

目前，有機(jī)溶劑萃取法是國內(nèi)外提取總多酚、總黃酮使用最廣泛的方法，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮及它們的水溶液[18-19]，本試驗(yàn)選取的溶劑與其相符。溶劑提取法的依據(jù)是相似相溶原理，由于不同溶劑其極性、分散性等性質(zhì)的差異導(dǎo)致其對藜麥種子中的多酚、黃酮類物質(zhì)的提取具有選擇性。目前對于藜麥總多酚、總黃酮類物質(zhì)的研究均使用的是單一溶劑，本試驗(yàn)通過超聲波浸提方法，利用不同有機(jī)溶劑提取藜麥種子中總多酚、總黃酮類物質(zhì)并對其抗氧化活性進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同有機(jī)溶劑提取的總多酚、總黃酮類物質(zhì)的含量不同，這一結(jié)果與不同有機(jī)溶劑提取高粱米中的提取物結(jié)果[20]一致。不同有機(jī)溶劑提取出的總多酚、總黃酮類物質(zhì)對DPPH、羥基自由基均具有一定的清除能力，且具有一定的鐵還原能力，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果[11，21]一致，不同有機(jī)溶劑提取出的總多酚、總黃酮類物質(zhì)其抗氧化活性間存在一定差異。相關(guān)性分析表明，總多酚含量與抗氧化活性具有顯著的相關(guān)性，而總黃酮類物質(zhì)的含量與抗氧化活性間的相關(guān)性較低，這是由于不同溶劑提取出的黃酮種類和物質(zhì)的含量不同，導(dǎo)致其本身性質(zhì)不同，不同種類的抗氧化活性不同，所以其含量與抗氧化活性間的相關(guān)性較低。根據(jù)本試驗(yàn)比較7種不同溶劑提取總多酚、總黃酮類物質(zhì)的含量及其抗氧化活性結(jié)果表明，70%乙醇適合作藜麥種子提取物及其抗氧化活性研究的溶劑。藜麥作為最適宜人類的全營養(yǎng)食品，其抗氧化活性成分還須進(jìn)一步分離鑒定，抗氧化活性作用及抗氧化機(jī)理還須進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用不同溶劑提取的藜麥種子提取物中總多酚、總黃酮含量與其抗氧化活性間存在一定差異。70%甲醇、70%乙醇作溶劑時，總多酚含量較高，分別為2.61、3.28 mg/g，其抗氧化活性較高，相關(guān)性研究表明，總多酚含量與抗氧化活性相關(guān)性較高；不同溶劑提取物中，總黃酮含量較高的是以蒸餾水、70%乙醇為溶劑時，分別為羥基自由基清除能力、鐵還原能力比70%乙醇提取物差1.98、1.94 mg/g，且兩者之間無顯著差異，但在蒸餾水提取物中，總黃酮的抗氧化性較差，考慮食品安全，甲醇是有毒物質(zhì)，因此70%乙醇是最適宜藜麥種子中總多酚、總黃酮類物質(zhì)提取的溶劑。