美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學(xué)分析

王亞琪， 郭 敏， 劉錚鑄， 耿立英， 張傳生， 鞏元芳， 李祥龍， 彭永東

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北秦皇島 066004)

水貂皮是一種珍貴的裘皮，顏色多種多樣，價格昂貴，有“裘皮之王”的美稱。貂皮顏色是水貂皮重要的質(zhì)量品質(zhì)性狀，也是影響其價格的重要因素。毛色的種類繁多，主要由黑色素的種類與分布不同控制[1]。黑色素是一種廣泛存在于動物、植物和微生物的生物色素，主要分布在人類或動物的皮膚、視網(wǎng)膜、膽囊及卵巢等部位。黑色素的產(chǎn)生或缺乏是動物形成不同毛色的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，而色素的形成是由不同基因間的相互作用與環(huán)境因素共同決定。哺乳動物的毛色是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的2種不同類型的黑色素——真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)的分布以及二者的比例決定的[2]。

酪氨酸酶相關(guān)蛋白質(zhì)1(TYRP1)，由gp75基因表達(dá)，又稱為brown蛋白質(zhì)，是第1個克隆成功的色素基因，該基因與酪氨酸酶編碼蛋白質(zhì)同源，定位于小鼠的brown位點(diǎn)。小鼠TYRP1基因長約18 kb，定位在第4號染色體，人TYRP1基因長37 kb，定位于染色體9p23，都由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，由外顯子2-8編碼，TYRP1與TYR基因核酸序列同源達(dá)43%；TYRP1與TYR基因mRNA轉(zhuǎn)錄后加工相似，都有可變性剪接，但不同的是在5′端上游調(diào)控區(qū)不含有TATA盒和CAATT盒[3-4]。研究表明TYRP1基因的變異與毛色密切相關(guān)。小鼠TYRP1基因編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)1處G/A突變，該突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸序列的改變，即半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，并且證實(shí)該突變導(dǎo)致棕色表型[5]。在狗中發(fā)現(xiàn)TYRP1基因外顯子2錯義突變(S41C)跟棕色表型有關(guān)[6]。Schmutz等發(fā)現(xiàn)在德克斯特牛(Dexter)中TYRP1基因編碼區(qū)一處C/T突變引起組氨酸變?yōu)槔野彼幔瑢?dǎo)致暗褐色表型[7]。索艾綿羊TYRP1基因外顯子4上存在一個非同義性突變(c.869T>C)，與其淺色表型相關(guān)[8]。豬TYRP1基因編碼區(qū)缺失6個堿基TGGGTA(c.1484_1489del)，與其褐色表型相關(guān)[9]。人的金色頭發(fā)與TYRP1基因中1個由肌氨酸到精氨酸的錯義突變有關(guān)，并使其通過隱性方式遺傳[10]。牛亞茹等發(fā)現(xiàn)英國史賓格犬TYRP1基因編碼區(qū)存在3個位點(diǎn)(T121A，C991T，P345Δ)多態(tài)性與其2種毛色密切相關(guān)[11]。郝曄等發(fā)現(xiàn)獺兔TYRP1基因編碼區(qū)C483T突變有利于真黑色素的合成[12]。

目前，關(guān)于水貂TYRP1基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究較少。本研究在已有水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)序列的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法對其理化性質(zhì)、疏水性、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域及其功能等進(jìn)行預(yù)測，基于鄰接法對不同物種TYRP1基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

美洲水貂TYRP1基因GenBank登錄號為KU186800.1，對該基因完整編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLAST分析；與其同源性較高的雪貂(XP_004765815.1)、家犬(NP_001181895.1)、赤狐(ALI89102.1)、北極熊(XP_008688074.1)、家貓(NP_001036025.2)、野豬(ALU33723.1)、綿羊(ACF21681.1)、山羊(AEF01557.1)、牛(AAL38167.2)、小家鼠(CAM22450.1)、大鼠(NP_001100134.1)和人(AAC15468.1)的TYRP1基因完整編碼蛋白質(zhì)序列下載自NCBI網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 水貂TYRP1基因開放閱讀框的確定 通過NCBI中的ORF finder確定水貂TYRP1基因開放閱讀框。

1.2.2 水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 通過ExPASy數(shù)據(jù)庫(http：//www.expasy.org/)提供的ProtParam在線程序預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、等電點(diǎn)、正負(fù)電荷殘基數(shù)、原子總數(shù)、摩爾消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等；通過ProtScale軟件預(yù)測疏水性。通過法國里昂CNRS的SOPMA軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，并利用SWISS-MODEL軟件[13](https：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域。通過CBS Prediction Servers數(shù)據(jù)庫(http：//www.cbs.dtu.dk /services/)提供的SignalP 4.1 Server在線程序判斷該基因編碼蛋白質(zhì)是否存在信號肽；通過TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；通過Scratch Protein Predictor軟件對該蛋白質(zhì)的二硫鍵進(jìn)行預(yù)測。通過NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0在線軟件對該蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。通過PSORT Ⅱ Prediction軟件(http：//psort.hgc.jp /form2.html)預(yù)測該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的具體存在位置。通過Protfun 2.2 Server軟件[14-15]預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)的功能分類。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 通過BioEdit 7.0軟件[16]對13個物種TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對分析，再利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法[17](neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲水貂TYRP1基因開放閱讀框分析

利用NCBI中的ORF finder對水貂TYRP1基因的開放閱讀框進(jìn)行定位。起始密碼子位于第5 483個核苷酸，終止密碼子位于第22 380個核苷酸，共編碼537個氨基酸。

2.2 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

從表1可知，亮氨酸和脯氨酸的含量較高，分別為8.9%和7.1%；等電點(diǎn)為5.74；帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為58個，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為44個；原子總數(shù)為8 351個，其分子式為C2 692H4 076N756O799S28。當(dāng)所有的半胱氨酸全部形成胱氨酸時，消光系數(shù)為82 820 mol/L，相應(yīng)的吸光度為1.364；當(dāng)所有的半胱氨酸均不能形成胱氨酸時，消光系數(shù)為81 820 mol/L，相應(yīng)的吸光度為1.348。哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞的半衰期為30 h。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為 49.47，表明該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪族氨基酸指數(shù)為71.90；親水性總平均值為-0.382，表明該蛋白質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)。

2.3 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析

圖1中的正值表示疏水性，該值越大疏水性越強(qiáng)，負(fù)值為親水性。由不同的氨基酸得分可知，多肽鏈第84位的精氨酸(Arg)分值最低(-3.133)，其親水性最強(qiáng)；第490位的纈氨酸(Val)和491位的丙氨酸(Ala)分值最高(3.411)，其疏水性最強(qiáng)。整條多態(tài)鏈呈親水性，表明TYRP1基因編碼產(chǎn)物為親水蛋白質(zhì)。

2.4 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要指肽鏈中的主鏈借助氫鍵有規(guī)則地卷曲折疊成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。使用SOPMA軟件預(yù)測水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(圖2)，結(jié)果表明α-螺旋(alpha helix)和無規(guī)卷曲(random coil)是水貂TYRP1蛋白質(zhì)的主要二級結(jié)構(gòu)元件，其中175個氨基酸(總氨基酸的32.59%)構(gòu)成α-螺旋， 215個氨基酸(總氨基酸的40.04%)構(gòu)成無規(guī)則卷曲；另外101個氨基酸(總氨基酸的18.81%)和46個氨基酸(總氨基酸的8.57%)分別形成伸展鏈(extended strand)和β-轉(zhuǎn)角(beta turn)。按照Skolnick等報(bào)道的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分型標(biāo)準(zhǔn)，水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)可歸為混合型[18-19]?；谕唇?預(yù)測模板為4d871.B)方法構(gòu)建的美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)見圖3。該蛋白質(zhì)存在較多的扭曲和折疊，結(jié)構(gòu)較為豐富，而這些結(jié)構(gòu)對其生物學(xué)功能的發(fā)揮有重要作用。

表1 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

2.5 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測

應(yīng)用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域。從預(yù)測結(jié)果可知，美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的第183～417個氨基酸區(qū)域?yàn)槔野彼崦赋易?tyrosinase superfamily)結(jié)構(gòu)域(圖4)。

2.6 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)信號肽、跨膜域與二硫鍵預(yù)測

由圖5可知，美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的分值曲線較為典型，其中，C得分(raw cleavage site score)為0.868，Y得分(combined cleavage site score)為0.875，S得分(signal peptide score)為0.943；切割點(diǎn)(cleavage site)在24～25位氨基酸內(nèi)，因?yàn)镃得分和Y得分均趨向于1，且S得分在切割點(diǎn)前高，在切割點(diǎn)后迅速變低，可判斷出美洲水貂TYRP1基因編碼產(chǎn)物存在信號肽。

運(yùn)用TMHMM軟件對該蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，美洲水貂TYRP1基因編碼產(chǎn)物共有1個跨膜區(qū)域：第479～501位(圖6)。第1～478位于胞外，第502～537位于胞內(nèi)。由此推斷，美洲水貂TYRP1基因編碼產(chǎn)物為1個跨膜蛋白質(zhì)。

運(yùn)用Scratch Protein Predictor軟件對該蛋白質(zhì)的二硫鍵進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，水貂TYRP1蛋白質(zhì)17個Cys中，14個Cys形成了7對二硫鍵。

2.7 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測

分別應(yīng)用NetPhos3.1和NetOGlyc4.0在線軟件對水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，水貂TYRP1蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有53個磷酸化位點(diǎn)和11個糖基化位點(diǎn)。磷酸化位點(diǎn)分別位于絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基上。其中有29個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、19個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和5個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖7)。

2.8 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位

通過PSORT Ⅱ Prediction軟件預(yù)測水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和質(zhì)膜的概率分別為44.4%、33.3%和22.2%，表明該蛋白質(zhì)主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮其生物學(xué)作用。

2.9 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的功能分類

由表2可知，美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)在細(xì)胞被膜、運(yùn)輸和結(jié)合、嘌呤和嘧啶中發(fā)揮的概率較大，分別為 0.804、0.834、0.563，作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答發(fā)揮作用的概率較大，分別為0.148、0.104，明顯高于其他功能。

表2 美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)功能分類預(yù)測

2.10 系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖8可知，雪貂(Mustelaputoriusfuro)和美洲水貂(Neovisonvison)之間的親緣關(guān)系最為接近，其次是家犬(Canislupusfamiliaris)、赤狐(Vulpesvulpes)、北極熊(Ursusmaritimus)、家貓(Feliscatus)、野豬(Susscrofa)、牛(Bostaurus)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、人類(Homosapiens)、大鼠(Rattusnorvegicus)和小家鼠(Musmusculus)。

3 討論與結(jié)論

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，動物毛色作為重要的經(jīng)濟(jì)性狀，不僅影響動物自身，如由于紫外照射引起的基因突變、偽裝模仿、躲避其他動物的捕食、社會交往和性別選擇[20]，同時對研究動物毛色的形成機(jī)制有所幫助。TYRP1基因是第1個克隆成功的色素基因，作為影響動物被毛顏色變異的重要候選基因，近年來得到廣泛關(guān)注。TYRP1基因能夠直接影響黑色素的合成，同時能穩(wěn)定和調(diào)節(jié)酪氨酸酶的催化活性，對維持黑色素小體結(jié)構(gòu)和黑色素細(xì)胞的增殖與凋亡有重要影響[21]。本研究通過生物信息學(xué)方法對美洲水貂TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、親疏水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、二硫鍵、亞細(xì)胞定位和功能分類等進(jìn)行預(yù)測和分析，該結(jié)果為研究TYRP1基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能提供了更多的信息。

TYRP1基因編碼產(chǎn)物共編碼537個氨基酸，其中亮氨酸含量最高。該蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，整條多肽鏈呈親水性，疏水區(qū)主要集中在第5～20個和475～501個氨基酸中，與小鼠和山羊TYRP1基因的蛋白質(zhì)序列所分析的疏水區(qū)域基本相同[22-23]。TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，存在二硫鍵和信號肽。該基因編碼蛋白質(zhì)是一種跨膜蛋白質(zhì)，存在1個跨膜區(qū)，并含有1個酪氨酸酶超家族結(jié)構(gòu)域，主要在細(xì)胞被膜、嘌呤和嘧啶、運(yùn)輸和結(jié)合中發(fā)揮作用，同時還參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答。有研究表明，TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到前黑色素小體內(nèi)發(fā)揮作用[24-25]，本研究對TYRP1基因編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位結(jié)果與之相符。水貂TYRP1基因與雪貂的親緣關(guān)系最為密切，其次是家犬、赤狐、北極熊、家貓、野豬、牛、綿羊、山羊、人類、大鼠和小家鼠，與動物學(xué)進(jìn)化觀點(diǎn)基本一致。由于不同物種間蛋白質(zhì)的同源性大于25%就可判斷其功能上的相似性[26]。因此，這種同源性不僅反映不同物種間的親緣關(guān)系，也表明不同物種TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性，同時說明TYRP1基因編碼蛋白質(zhì)在長期的生物進(jìn)化中主要受凈化選擇作用的約束，保守性比較強(qiáng)。

美洲水貂TYRP1基因共編碼537個氨基酸，其編碼產(chǎn)物為不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)。二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，含有1個酪氨酸酶超家族結(jié)構(gòu)域，存在信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和二硫鍵。該蛋白質(zhì)主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮細(xì)胞被膜、運(yùn)輸和結(jié)合的作用，同時還通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)作用。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，美洲水貂TYRP1基因在生物進(jìn)化過程中符合動物學(xué)分類，具有較高的保守性。該生物信息學(xué)分析結(jié)果為水貂TYRP1基因遺傳特性及編碼蛋白質(zhì)功能機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。