江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)白血病CEM細(xì)胞的抑制作用*

★ 周軍 朱金華 余雄英 朱大誠 潘榮斌 周紅 歐陽永偉（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.南昌縣疾病控制中心 南昌 33000）

關(guān)鍵字：眼鏡蛇毒；細(xì)胞毒素；CEM細(xì)胞；抑制；細(xì)胞凋亡

眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素（Cytotoxin，Cardiotoxin）是眼鏡蛇毒的主要毒性成分之一，約占粗毒總蛋白的40%左右［1］。大量研究表明眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)白血病腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，這引起了國內(nèi)外廣大生物毒素抗腫瘤科研工作者的極大興趣［2-8］。

急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-cell Acute lymphoblastic Leukemia，T-ALL）是一類最常見造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，具有易復(fù)發(fā)，預(yù)后差的典型特征［9-10］。隨著醫(yī)療科技的高速發(fā)展，經(jīng)過規(guī)范和強(qiáng)化治療，該病的兒童五年無病生存率顯著提高，達(dá)到70%～75%；然而成人患者的五年無病生存率僅有20%～50%［10］。究其原因，主要是臨床缺乏合適的治療藥物和方案，成人治療仍然還是按照兒童的治療方案進(jìn)行治療［10-11］。針對(duì)這一情況，本研究采用從江西眼鏡蛇原毒分離純化的細(xì)胞毒素作用急性T淋巴細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞株，應(yīng)用CCK-8法觀察眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞的增殖抑制作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。本研究將為開發(fā)眼鏡蛇細(xì)胞毒素應(yīng)用于臨床治療急性淋巴細(xì)胞性白血病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物 江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素（眼鏡蛇由江西省南豐縣洽灣蛇場飼養(yǎng)，經(jīng)鑒定屬于中華眼鏡蛇（Naja naja atra）。眼鏡蛇原毒經(jīng)CM-SephadexG50柱層析分離并經(jīng)SP-SephadexG50柱純化、脫鹽、凍干后獲得，實(shí)驗(yàn)室制備批號(hào)900622；詳細(xì)制備方法見參考文獻(xiàn)［12］）

1.2 細(xì)胞株 白血病CEM細(xì)胞，購自天津市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，液氮保存。

1.3 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），小牛血清（Gibco），PierceTMBCA Protein Assay Kit購 自美國Thermo Fisher公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸，乙腈，三氟乙酸購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒（Dojindo）購自日本同仁化學(xué)研究所；Anti-Caspase-3 antibody［E87］（ab32351），Anti-Caspase-8 antibody［E6］（ab32125） 購 自 美 國Abcam 公 司；β-Actin（13E5）Rabbit mAb，Antirabbit IgG，HRP-linked Antibody購自美國CST公司，RIPA Buffer，PMSF購自碧云天公司。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；Bio-Rad蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Fluor Chem M凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司）；Spectra max plus 384酶標(biāo)儀（美國Molecular device公司）；IX70-142熒光倒置顯微鏡（BX43顯微拍照系統(tǒng)，日本OLYMPUS公司）；4700 MALDITOF/TOF-MS（美國Apply Biosystems公司）。

2 方法

2.1 分子量的測定 取濃度為1mg/mL眼鏡蛇細(xì)胞毒素2μL等比例與基質(zhì)CHCA［0.4mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）溶液，溶劑為50%乙腈/0.1%三氟乙酸］混合，然后點(diǎn)于靶板上干燥結(jié)晶后，MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀分析獲得譜圖。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥 白血病CEM細(xì)胞培養(yǎng)于含15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每2天換液1次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔2×105個(gè)/mL接種90μL于96孔板，然后按每列每孔加入10μL不同濃度（濃度依次為80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625μM）的細(xì)胞毒素溶液（用培養(yǎng)基配制后0.22μm膜過濾）分別在6，12，24，48，72h。不加藥對(duì)照組只加等量RPMI1640培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加RPMI1640和等量dH2O，每組設(shè)6個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞增殖抑制率測定 在進(jìn)行數(shù)據(jù)測定前1h，于96孔板每孔中加入10μL CCK-8進(jìn)行孵育。孵育結(jié)束后，置于酶標(biāo)儀上振蕩15s后450nm下測定吸光度（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD）/（不加藥對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD）］×100%

2.4 倒置顯微鏡觀察不同濃度對(duì)CEM細(xì)胞的影響 取實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察24h后藥物對(duì)細(xì)胞的抑制效果并拍照。

2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分組，處理方法與培養(yǎng)時(shí)間參照細(xì)胞培養(yǎng)與給藥部分。分別取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液離心涂片，用Giemsa染色，用蒸餾水洗滌，二甲苯透明后用中性樹脂進(jìn)行封片保留至顯微拍照系統(tǒng)進(jìn)行光鏡下觀察并拍照。

2.6 蛋白提取 取對(duì)數(shù)生長期的CEM細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)終濃度3×105個(gè)/mL，分瓶，5mL/瓶，按照細(xì)胞培養(yǎng)與給藥部分處理方法處理細(xì)胞后，500g離心10min，去掉上清液，加入預(yù)冷pH7.4的PBS 5mL重懸細(xì)胞，500g再次離心10min，共洗滌2次以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片。將收集到的各組細(xì)胞各加入適量的RIPA裂解液（RIPA：PMSF=100：1）裂解細(xì)胞，在冰上裂解30min；收集細(xì)胞裂解液放入1.5mLEppendorf管中，4℃下15000g離心10min。取上清蛋白液，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.7 蛋白質(zhì)濃度測定 蛋白濃度的測定使用BCA蛋白測試試劑盒。操作過程簡述如下：按等比配置好7個(gè)濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品，取各組蛋白樣品25μL分別加入到標(biāo)記好的96孔微板中，向每孔中添加200μLBCA工作液，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，冷卻至室溫后，于562nm下在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測。繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線后代入待測樣品吸光度計(jì)算出待測樣品中的蛋白濃度。如果待測樣品濃度過大，需用PBS稀釋后再次測定。

2.8 Western Blotting檢測Caspase-3和caspase-8蛋白表達(dá) 取上述制備的細(xì)胞總蛋白20μg按10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳操作步驟加入相關(guān)試劑后加熱10min進(jìn)行蛋白變性，上樣至預(yù)制膠中后進(jìn)行電泳，電泳條件為恒壓200V，電泳時(shí)間為50min。電泳結(jié)束后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓70V，時(shí)間為90min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，蛋白印記好的PVDF膜用TBS/0.1%Tween-20（TBST，pH 7.6）洗滌5min后置于封閉液（5%牛奶TBST溶液）室溫封閉1h，TBST洗滌3次，每次10min。爾后將膜置于一抗溶液（按一抗說明書比例進(jìn)行稀釋）4℃慢搖孵育過夜。孵育結(jié)束后移除一抗溶液后，用TBST洗滌3次，每次10min。滴加二抗溶液（Anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody，1∶2000稀 釋 于 5% 牛 奶TBST溶液中）室溫孵育1h后再次用TBST洗滌3次，每次10min，加入化學(xué)發(fā)光檢測試劑于暗光條件進(jìn)行條帶顯色1min后置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光檢測。以β-Actin為內(nèi)參，檢測的條帶用Quantity One4.6.2軟件進(jìn)行分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用單因素方差分析；P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素分子量 經(jīng)MALDITOF/TOF質(zhì)譜儀分析獲得譜圖可知，本實(shí)驗(yàn)室從江西眼鏡蛇原毒分離制備的細(xì)胞毒素分子量為6776.6Da，質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析圖

3.2 江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞增殖抑制率的影響 用細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒素在6h就對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，且抑制率隨細(xì)胞毒素濃度的增加而增加；尤其在高劑量時(shí)抑制率增加明顯。而在使用相同濃度的細(xì)胞毒素作用細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在高濃度時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長，抑制率出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)；在作用24h時(shí)抑制率達(dá)到最大，此時(shí)IC50為1.613μM。而低濃度的細(xì)胞毒素隨作用時(shí)間的延長，抑制率反而降低。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞增殖抑制率的影響（，n=6）

表1 不同濃度江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞增殖抑制率的影響（，n=6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

時(shí)間/h抑制率/% IC50/μM 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 6 13.7324.73*18.92*24.95*28.63 37.32 46.81*49.74*8.294 12 1.16 3.82 3.81 10.35 13.10*31.95*49.33*57.92*4.949 24 1.65 3.42 3.93 16.24 49.59*61.97*72.45*80.89*1.613 48 1.61 1.99 4.44 3.49 24.42*43.27*62.06*72.83*2.929 72 0.18 2.26*2.34 0.45 5.43 31.41*62.33*79.78*3.357

3.3 倒置顯微鏡觀察不同濃度眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞增殖的影響 倒置顯微鏡下觀察到，對(duì)照組細(xì)胞多且飽滿，大小均一，部分細(xì)胞有側(cè)凸，細(xì)胞折光能力很強(qiáng)（圖2A）；而用細(xì)胞毒素作用24h后，各給藥組細(xì)胞數(shù)目隨濃度的增加而有所減少，細(xì)胞變小而且折光能力也有不同程度下降（圖2B，2C，2D），尤其在高劑量組中，細(xì)胞折光能力改變更為明顯并且出現(xiàn)了大量細(xì)胞碎片（圖2D）。

圖2 不同濃度眼鏡蛇細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞24h的影響（×200倍）

3.4 不同濃度眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察到，對(duì)照組細(xì)胞著色深，大小基本一致，核大且核漿比例失調(diào)（圖3A）。在各給藥組CEM細(xì)胞體積明顯縮小，且與臨近細(xì)胞分離明顯（圖3B，3C）。在高劑量組，有些細(xì)胞出現(xiàn)胞膜皺縮，染色質(zhì)凝聚成塊，甚至還個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀，胞質(zhì)外溢等典型凋亡細(xì)胞特征（圖3D）。

圖3 不同濃度眼鏡蛇細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞24h的形態(tài)學(xué)變化（×400倍）

3.5 不同濃度眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞Capase-3、Capase-8蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，眼鏡蛇細(xì)胞毒素各濃度組的Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)均有增加，以高濃度（2μM）組增加明顯，見表2和圖4。

表2 不同濃度眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞24h對(duì)Caspase-3、Caspase-8蛋白與內(nèi)參β-Actin 蛋白表達(dá)比值（，n=6）

表2 不同濃度眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞24h對(duì)Caspase-3、Caspase-8蛋白與內(nèi)參β-Actin 蛋白表達(dá)比值（，n=6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 Caspase-3/β-Actin Caspase-8/β-Actin對(duì)照組 0.7499±0.0663 0.6610±0.0597 0.125μM 組 0.8926±0.1168 0.8717±0.1095 0.5μM 組 0.9251±0.0885* 0.9445±0.1602*2μM 組 0.9993±0.0643* 1.0045±0.1212*

圖4 不同濃度眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞24h對(duì)Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響

4 討論

本研究采用細(xì)胞毒素是從江西眼鏡蛇原毒分離純化的，經(jīng)質(zhì)譜分子量測定，發(fā)現(xiàn)和文獻(xiàn)［13-14］報(bào)道的細(xì)胞毒素分子量存在差異。這種差異產(chǎn)生的原因可能是由于眼鏡蛇所屬產(chǎn)地不同，其分泌的蛇毒細(xì)胞毒素存在種屬特異性差異；也有可能是分離純化方法不同而導(dǎo)致分離到不同的細(xì)胞毒素所造成的分子量差異。CCK-8試劑檢測其對(duì)CEM細(xì)胞作用的研究結(jié)果表明，該細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞在6h就產(chǎn)生抑制作用，而且抑制程度隨藥物濃度增加而增加；呈典型的劑量依賴性；而在同一濃度作用下，抑制作用隨時(shí)間延長呈現(xiàn)出先增加后有所降低的趨勢(shì)，最佳的作用時(shí)間在24h。此時(shí)，IC50為 1.613μM（10.93μg/mL），該 IC50值與文獻(xiàn)［14］報(bào)道相接近，但是與文獻(xiàn)［6］報(bào)道相差較大。我們認(rèn)為造成這種差異的原因可能與細(xì)胞株類型、蛇毒細(xì)胞毒素類型等有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步的研究。在抑制率結(jié)果分析中，需特別指出兩點(diǎn)：（1）在0.125μM細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞6h時(shí)，平均抑制率達(dá)24.73%，該抑制率與0.5μM所產(chǎn)生的抑制率相當(dāng)，我們無法解釋這一結(jié)果，需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步尋找原因。（2）細(xì)胞毒素在低濃度（0.25μM以下）時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長，抑制作用迅速下降。分析產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于細(xì)胞毒素本身屬于蛋白，當(dāng)開始作用時(shí)，被抑制的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡壞死后，細(xì)胞內(nèi)含的蛋白水解酶類除可以將自身的蛋白降解以外，還可以將一定量的細(xì)胞毒素也降解；使得細(xì)胞毒素含量下降進(jìn)而產(chǎn)生的抑制作用降低。這一解釋似乎也可以解釋為什么在細(xì)胞毒素作用CEM細(xì)胞48h乃至72h后，其抑制作用并沒有明顯增加，反而有所降低。當(dāng)然，這種解釋需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。為進(jìn)一步地驗(yàn)證細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞的抑制作用，我們選擇在抑制作用效果最明顯的24h時(shí)進(jìn)行倒置顯微鏡鏡下直接觀察。觀察結(jié)果也證實(shí)了江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素對(duì)CEM細(xì)胞有抑制作用，且抑制作用與給藥劑量成正相關(guān)。

據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，眼鏡蛇細(xì)胞毒素可通過細(xì)胞膜死亡受體、線粒體等相關(guān)凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡從而抑制白血病腫瘤細(xì)胞K562、U937、HL-60等增殖［2-8］。我們先對(duì)細(xì)胞毒素作用后的CEM細(xì)胞進(jìn)行Giemsa染色，染色結(jié)果顯示有些細(xì)胞出現(xiàn)胞膜皺縮，染色質(zhì)凝聚成塊，甚至還個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀等典型凋亡細(xì)胞特征。進(jìn)一步對(duì)Caspase-8、Caspase-3進(jìn)行Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)，江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素可以促進(jìn)凋亡啟動(dòng)和效應(yīng)蛋白Caspase-8、Caspase-3的表達(dá)。這些研究結(jié)果均提示江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素也可通過誘導(dǎo)CEM細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑制作用；但江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素是如何調(diào)控這些凋亡途徑來發(fā)揮抑制作用有待后續(xù)進(jìn)一步地研究來闡明。

綜上所述，江西眼鏡蛇細(xì)胞毒素可以抑制CEM細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)CEM細(xì)胞凋亡有關(guān)。