HPLC法測定板藍根中抗病毒化學物質組的含量*

★ 肖雪 馬晉芳 羅國安（1.廣東藥科大學中醫(yī)藥研究院 廣州 510006；2.清華大學化學系 北京 100084；3.中山大學南沙研究院 廣州 511458；4.中山大學藥學院 廣州 510006）

板藍根（Isatidis Radix）為十字花科植物菘藍（Isatis tinctoriaL.）的根，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，主要用于溫熱病發(fā)熱、頭痛、喉痛，或溫毒發(fā)斑、痄腮、癰腫瘡毒、丹毒、大頭瘟疫等多種熱毒熾盛之證［1-2］。在近十年中，板藍根在抗擊非典、甲流等傳染病中發(fā)揮了重要的作用［3-5］。雖然板藍根在臨床中應用廣泛，但是板藍根抗病毒成分的質量控制指標不完善［6-8］，《中國藥典》（2015年版）僅規(guī)定了（R，S）-告依春作為板藍根水溶性成分的含量測定項。本試驗擬從化學物質組學［9］的角度，開展不同產地板藍根中抗病毒化學物質組的含量測定研究，在既往的研究基礎［10］上，采用HPLC法同時測定板藍根中文獻中報道的抗病毒化學物質組-尿苷、腺苷、鳥苷和（R，S）-告依春的含量。本研究可為不同產區(qū)板藍根質量評估提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 series LC液相色譜系統(tǒng)（包括：二元梯度泵、二極管陣列檢測器、柱溫箱、Chemstation化學工作站等）（美國Agilent公司）；XS105型電子天平（d=0.01mg，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司）；SL300N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；RUG-5200型超聲波清洗器（上海銳祺電子設備有限公司）；XJD-250B型微型高速粉碎機（姜堰市銀河儀器廠）；Milli-Q超純水儀（默克密理博公司）。

1.2 材料 尿苷（批號110887-200202）、腺苷（批號110879-200202）、（R，S）-告依春（批號111753-201304）對照品購于中國藥品生物制品檢定院；鳥苷（批號1309326-61607015）標準品采購于Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司），甲酸、乙醇等為分析純（天津市大茂化學試劑廠）。

板藍根藥材，產地分別為河南（HN）、河北（HB）、東北（DB）、甘肅（GS）、甘肅河西（HX）、甘肅武威（WW）、安徽（AH）、黑龍江（HLJ），由廣州白云山明興制藥有限公司提供，經該公司陳文榮高級工程師鑒定為十字花科植物菘藍（Isatis tinctoriaL.）的根。

2 方法與結果

2.1 色 譜 條 件［9］色 譜 柱：Phenomenex C18柱（4.60mm×250mm，5μm），流動相條件：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～12%B（0～42min），12%～19%B（42～65min）；流速：0.5mL/min，檢測波長254nm、240nm，柱溫25℃，進樣量：10μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取尿苷對照品4.42mg，腺苷對照品4.93mg，鳥苷對照品4.84mg，（R，S）-告依春對照品3.54mg，分別置10mL容量瓶中量瓶中，用10%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合標準品溶液。將混合標準品溶液各取適量置于10mL量瓶中，加入10%甲醇溶液至刻度，搖勻配制成一系列不同濃度的混合標準品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取板藍根粉末（過3號篩）約0.5g，精密加入10%甲醇50mL，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率50KHz）10min后，再回流提取50min，放冷，用10%甲醇補足缺失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白干擾試驗 取供試液、尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春的混合對照液和缺板藍根的空白液，各進樣10μL。結果表明尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春對照液和供試品溶液均呈現(xiàn)吸收峰，而空白液在與對照品相應的位置上沒有色譜峰出現(xiàn)，如圖1所示，表明本測定無干擾。

圖1 板藍根標準品溶液色譜圖（A）與空白對照圖（B）

2.5 線性關系考察 精密吸取上述混合對照品溶液，分別進樣10μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積積分值。以尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春的回歸方程分別為：Y=29923X+25300，R2=0.9997；Y=44814X+116966，R2=0.9996；Y=56713X+74922，R2=0.9998；Y=131480X+72635，R2=0.9999。尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春分別在 4.416～441.6μg/mL、4.848～484.8μg/mL、4.928～492.8μg/mL、3.356～353.6μg/mL 范 圍 內 線性關系良好。

2.6 精密度試驗 取同一對照品連續(xù)進樣6次，結果尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次為0.96、0.84、0.84、0.65，說明本方法精密度良好。

2.7 重復性試驗 取板藍根藥材按照藥材供試品制備方法平行制備供試品6份，結果尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次為2.8、2.4、1.1、1.1，說明本方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 按照供試品溶液制備方法制備一份供試品，分別在0、2、4、6、8、12、24h進樣，結果尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次為1.1、0.84、0.93、1.1，說明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一組板藍根藥材，加入各成分對照品適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下方法進行分析。結果顯示，尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春的平均加樣回收率分別為99.64%、98.85%、98.94%和100.10%。結果如表1。

2.10 樣品測定 按照供試品溶液的制備方法制備8個產地板藍根樣品，按照上述色譜條件測定，計算含量，色譜圖如圖2，結果見表2。

表1 加樣回收率考察結果

圖2 各產地板藍根藥材HPLC圖（A：HN，B：HB：C：DB，D：GS；E：HX；F：WW；G：AH，H：HLJ；1.尿苷，2.腺苷，3.鳥苷，4.（R，S）-告依春）

表2 各產地板藍根藥材抗病毒成分含量 μg/mL

3 討論

3.1 提取方法的選擇 有文獻報道按照藥典方法，通過水提醇沉工藝來考察板藍根中核苷類成分的含量［11］，此方法容易產生誤差，結合文獻［12］本文通過加約100倍量10%甲醇溶液在超聲處理后，再進行回流提取，操作簡單易行。

3.2 流動相的選擇 已有文獻報道用HPLC法測板藍根藥材及其制劑中尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S）-告依春中一個或多個成分的含量［12-15］。本試驗在文獻［10］研究的基礎上所選擇的0.1%甲酸水和乙腈為流動相，梯度洗脫的色譜條件，可用于板藍根的藥材、飲片制備、制劑等相關產品生產過程的質量控制。

3.3 化學物質組學研究 化學物質組學是指一定條件下輸入生物體系的所有化學物質（化學成分）組成的復雜化學體系，其研究的是在復雜性科學理論的指導下，采用層次化、系統(tǒng)化及逐步優(yōu)化的研究策略，而且首先要強調整體有效，即能夠產生預期的生物學響應［9］。有文獻報道板藍根中的鳥苷、腺苷、尿苷等核苷有抗病毒作用，近年來也有研究發(fā)現(xiàn)（R，S）-告依春的抗病毒活性，而且在板藍根這四種活性成分含量較高，可以將其看成一個化學物質組作為板藍根質量控制的指標，進一步控制板藍根藥材的質量以及板藍根在抗病毒中成藥中的應用。

3.4 結論 由表2可知，每個產地的板藍根藥材所含的核苷類成分含量較大，如果以核苷類成分作為主要控制指標，則HB、DB、HX三地產板藍根質量較好；如果以（R，S）-告依春作為含測指標，則AH產板藍根質量較好，其他地區(qū)所產板藍根（R，S）-告依春的含量差別不大；如果以化學物質組總含量作為評價指標，則AH產、HB產和DB產板藍根質量較好。同樣，以甘肅地區(qū)為例，每個產區(qū)指標的含量差異也比較明顯，沒有特別的規(guī)律性。本試驗所收集的樣本尚較少，每個產區(qū)僅一批樣品，尚不足以代表各個產區(qū)板藍根的質量，本試驗僅以此作為一研究思路供研究使用。