枸杞多糖體外抗腫瘤及免疫學(xué)

孫云龍 龐 博 劉 鑫 褚 穎 (長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)，是我國的傳統(tǒng)藥材〔1〕。枸杞子具有滋陰補(bǔ)血、益氣明目之功效〔2〕?，F(xiàn)代藥理研究表明，枸杞具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠延緩衰老及抗氧化〔3〕、抗輻射損傷、降血糖〔4〕、降血脂〔5〕、保護(hù)生殖系統(tǒng)〔6〕及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡〔7〕。枸杞多糖為枸杞中最重要的成分，是一種復(fù)雜的混合物，盡管人們對枸杞多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了多方面的研究并取得了很多成果，但目前枸杞多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用的機(jī)制尚未十分清楚〔8〕。本文研究枸杞多糖在體外的抗腫瘤作用及其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Electro Corporation)，CKK-41熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，超凈工作臺(AIR TECH)，高速冷凍離心機(jī)(美國Sigama公司)，Rainbow酶聯(lián)免疫酶標(biāo)測定儀(奧地利Tecan公司)，OlympusbX51凝膠成像系統(tǒng)(日本O-lympus公司)，DGG-9030電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，LNG-T83臺式離心濃縮儀(江蘇太倉醫(yī)療器械廠)。

1.2 細(xì)胞株及試劑 細(xì)胞株 RAW264.7、HepG2、SGC-7901及K562均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。枸杞多糖為實(shí)驗(yàn)室通過水提醇沉法制備并精制(純度為65.2%)，RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、特級胎牛血清(美國 Gibco公司)，Trypsin(美國 Sigma公司)，青-鏈霉素雙抗(長春華大中天公司)，抗體(武漢三鷹生物科技公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、聚氰基丙烯醇正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(碧云天生物科技有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 CCK-8法測體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用 人肝癌細(xì)胞 HepG2、胃癌細(xì)胞 SGC-7901及白血病細(xì)胞K562培養(yǎng)于DMEM/F12(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO237℃培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化，以1×104個的密度接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，給藥處理。每孔加藥10 μl，每個濃度平行6個復(fù)孔。陽性對照組中加1 mg/L順鉑，陰性對照組加入等量無血清無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為 10、50、100、200、400 μg/ml枸杞多糖處理 48 h后，每孔中加入 10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育2～4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值，計(jì)算抑制率，抑制率%=1－(OD給藥組/OD陰性對照組)×100%。

1.4 Western印跡實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，接種于6孔板，密度1×105個，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，分別加入濃度為 50、100、200、400 μg/ml枸杞多糖處理48 h，陽性對照組加入紫杉醇1 mg/L，空白對照組加入無血清無抗生素RPMI1640培養(yǎng)基，處理48 h。將細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑混合物和100 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的預(yù)冷裂解緩沖液中裂解5 min。在10%SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)，通過濕法電泳轉(zhuǎn)移到NC膜上，并用5%脫脂奶粉在三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)緩沖液(50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl和0.2%吐溫20)室溫中封閉1 h。將膜與一抗在4℃下孵育過夜，二抗孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌并使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯現(xiàn)免疫反應(yīng)條帶。

1.5 ELISA法檢測枸杞多糖對單核巨噬細(xì)胞RAW264.7腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌的影響 選擇對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，接種于96孔板，密度1×104個，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組按照 100、200、400 μg/ml劑量加入枸杞多糖，空白對照組加入等量無血清無抗生素RPMI1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入10 μg/ml的脂多糖(LPS)，放入37℃，5%CO2中培養(yǎng)。24 h后取上清，用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。按照一定的濃度梯度配制血清細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、GM-CSF 標(biāo)準(zhǔn)溶液，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均于37℃孵育2 h，棄上清。除空白對照組外各孔分別加入生物素化小鼠TNF-α、IL-1β、GM-CSF 抗體 50 μl，于 37℃孵育 90 min，棄上清。用沖洗液沖洗，之后加入Streptavidin-辣根過氧化物酶(HRP)溶液100 μl，室溫孵育 30 min，棄上清，加入酶反應(yīng)底物 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 溶液100 μl，室溫避光孵育 15 min，加入 100 μl終止液停止孵育，使用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算TNF-α、IL-1β及GM-CSF的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 枸杞多糖濃度在 200 mg/L時，對 SGC-7901、K562、HepG2細(xì)胞增殖有較強(qiáng)抑制作用，但抑制率明顯低于陽性對照組。見表1。

表1 枸杞多糖對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用(n=6，)

表1 枸杞多糖對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用(n=6，)

與陰性對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 SGC-7901K562HepG2 OD值 抑制率(%)OD值 抑制率(%)OD值 抑制率(%)陰性對照組 0.790±0.04 － 0.780±0.04 － 0.764±0.03 －陽性對照組(DDP) 0.252±0.032) 68.10±8.11 0.161±0.032) 79.36±14.79 0.257±0.082) 66.36±20.66枸杞多糖 10 mg/L 0.747±0.021) 5.44±0.15 0.726±0.041) 6.92±0.38 0.733±0.011) 4.06±0.06 50 mg/L 0.706±0.052) 10.63±0.75 0.713±0.021) 8.59±0.24 0.697±0.041) 8.77±0.50 100 mg/L 0.702±0.082) 11.14±1.27 0.699±0.071) 10.38±1.04 0.683±0.091) 10.60±1.40 200 mg/L 0.563±0.042) 28.73±2.04 0.655±0.032) 16.03±0.73 0.570±0.052) 25.39±2.23 400 mg/L 0.678±0.072) 14.18±1.46 0.707±0.042) 9.36±0.53 0.564±0.042) 26.18±1.86

2.2 Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 枸杞多糖能夠抑制Caspase-8，Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，但促進(jìn)及抑制作用均弱于陽性對照組，見圖1。

2.3 ELISA法檢測枸杞多糖對單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 TNF-α、IL-1β及GM-CSF分泌的影響 枸杞多糖對RAW264.7分泌TNF-α有較弱的促進(jìn)作用，其促進(jìn)效果不及陽性對照組;枸杞多糖能夠促進(jìn)RAW264.7分泌IL-1β，效果為空白對照組的3～6倍，其中400 μg/ml組的促進(jìn)效果可與陽性對照組持平;枸杞多糖能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌GM-CSF，效果為空白對照組的4～6倍，但促進(jìn)效果遠(yuǎn)不及陽性對照組。見表2。

圖1 枸杞多糖對SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-8及Bax的作用

表2 枸杞多糖對RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、GM-CSF的影響(，n=6，pg/ml)

表2 枸杞多糖對RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、GM-CSF的影響(，n=6，pg/ml)

與空白對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 TNF-α IL-1β GM-CSF空白對照組 728.13±100.90 6.73±0.54 6.56±0.57陽性對照組 2 426.50±258.412) 360.00±4.902) 452.44±59.802)枸杞多糖 100 μg/ml 924.50±76.801) 19.73±2.472) 26.75±3.722)200 μg/ml 1 078.38±109.602) 30.46±2.862) 27.06±3.172)400 μg/ml 1 202.50±113.762) 35.18±4.072) 34.72±4.982)

3 討論

中藥材重金屬含量測定的聯(lián)查報(bào)告數(shù)據(jù)證實(shí)常見的各種中藥材中，枸杞的重金屬含量測定全部顯示無污染〔9〕，所以枸杞以其良好的生物安全性被醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注，其中枸杞多糖為枸杞的最主要成分，且枸杞多糖在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面上都有明顯的效果〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖濃度在200 mg/L時對SGC-7901、HepG2細(xì)胞增殖有抑制作用，對K562有較弱的增殖抑制作用，表明枸杞多糖可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長來起到抗腫瘤作用。

巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中地位比較重要，吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)是對病原微生物入侵最早做出應(yīng)答的細(xì)胞類型，是天然免疫應(yīng)答的主要參與者〔12，13〕，激活的巨噬細(xì)胞能抑制多種腫瘤細(xì)胞和病原微生物〔14〕，與腫瘤的治療息息相關(guān)。枸杞多糖可能是枸杞中起到免疫調(diào)節(jié)的主要成分，認(rèn)為其抗腫瘤可能與枸杞多糖的免疫增強(qiáng)作用有關(guān)，可能機(jī)制有:抑制腫瘤細(xì)胞的生長，使TNF活性升高;對腫瘤細(xì)胞周期，血管生成、凋亡產(chǎn)生影響;和其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同抗腫瘤作用〔15，16〕。本研究表明，枸杞多糖是通過激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)IL-1β、TNF-α和GMCSF產(chǎn)生而發(fā)揮免疫作用的。

人Bcl-2是一個定位于核膜部分位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜的癌蛋白，可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，延長細(xì)胞壽命，在成熟或即將被消除的細(xì)胞中表達(dá)下降，其同源基因Bax可拮抗Bcl-2的保護(hù)作用而使細(xì)胞趨于凋亡，紫杉醇是從紫杉樹皮中提取的一種新型廣譜抗癌藥，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于各種晚期腫瘤的治療，療效顯著〔17〕，所以在本實(shí)驗(yàn)中以紫杉醇作為對照。本研究表明，枸杞多糖具有抗腫瘤作用可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞增長，促進(jìn)分泌血清細(xì)胞因子，上調(diào)促凋亡蛋白和下調(diào)抑制凋亡蛋白來實(shí)現(xiàn)的。

腫瘤治療的一般手段就是手術(shù)、放療和化療，但是費(fèi)用昂貴且治愈率低，目前對腫瘤的治療效果仍不理想，因此目前從中草藥中開發(fā)具有抗腫瘤的活性成分已經(jīng)成為當(dāng)前抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。中藥多糖以其抗腫瘤活性、免疫活性而備受關(guān)注，且毒副作用較小〔18〕。本實(shí)驗(yàn)表明，枸杞多糖具有體外細(xì)胞增殖抑制作用，但是其抑制作用不如順鉑，其抑制作用的機(jī)制尚未進(jìn)行研究，可通過后續(xù)研究進(jìn)行深入、全面、系統(tǒng)的分析研究。