GTP連接蛋白4在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

章諾貝 陳 新 (南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第五大常見的惡性腫瘤，在我國，HCC的死亡率高居惡性腫瘤死亡率的第2位〔1〕。HCC的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多基因相互作用的結(jié)果，包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因激活和抑癌基因失活、細(xì)胞凋亡和增殖調(diào)節(jié)失控等。關(guān)于HCC發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。GTP連接蛋白(GTPBP)是指能與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合，具有GTP水解酶活性的一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，由α、β、γ 3個不同亞基組成，其在細(xì)胞信號傳遞轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架形成、蛋白質(zhì)合成等細(xì)胞的多種生命活動中均發(fā)揮重要作用〔2〕。GTPBP4編碼基因是廣泛存在于從酵母到人類各種真核生物中的高度保守基因〔3〕。近來有研究報道，GTPBP4表達(dá)減弱可使人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖受到抑制，而GTPBP4的表達(dá)升高又與結(jié)腸癌和乳腺癌患者生存率下降有關(guān)〔4，5〕。本文擬分析GTPBP4在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

1.1.1 新鮮HCC組織標(biāo)本 于2015年4～11月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮HCC組織標(biāo)本25例，標(biāo)本均包含HCC組織及距癌灶距離≥2 cm的無瘤正常肝組織。術(shù)中切除后30 min內(nèi)立即將標(biāo)本置入液氮罐中，隨后于－80℃冰箱中儲存待用。

1.1.2 HCC組織芯片 75例HCC組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，人HCC組織芯片編號:HLiv-HCC150CS-02。HCC的大小、數(shù)目、血管侵犯、淋巴結(jié)侵犯和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的描述主要借鑒國際抗癌聯(lián)盟/美國腫瘤聯(lián)合會(UICC/AJCC，2010)標(biāo)準(zhǔn)。肝癌的病理分級運(yùn)用Edmondson-Steiner四級法表示〔6〕，Ⅰ級:癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞相似，細(xì)胞質(zhì)呈嗜伊紅，并偶見膽汁小滴;細(xì)胞核圓且規(guī)則，核仁明顯，分裂相較少，核質(zhì)之比接近正常，細(xì)胞排列成條索狀，索梁間血竇明顯、清晰，并襯以單層內(nèi)皮細(xì)胞。Ⅱ級:癌細(xì)胞略異形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒較為明顯，細(xì)胞核體積較大，核質(zhì)比例增大;細(xì)胞核染色深淺不一致，核仁較明顯，分裂相較多，常見腺泡狀排列。Ⅲ級:癌細(xì)胞異形明顯，胞質(zhì)嗜蘇木素，膽汁小滴少;細(xì)胞核體積大，而且形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核染色質(zhì)較粗，且染色質(zhì)分布紊亂，核仁較多，且顯示明顯，并呈現(xiàn)瘤巨細(xì)胞。細(xì)胞排列分布不規(guī)則，細(xì)胞分裂相多。Ⅳ級:癌細(xì)胞形態(tài)變異明顯，見多量梭形細(xì)胞，細(xì)胞排列極度紊亂，無結(jié)構(gòu)形態(tài);細(xì)胞質(zhì)少，而細(xì)胞核大，核仁形態(tài)極度不規(guī)則。其中，男63例，女12例;年齡34～77歲，平均52歲;腫瘤大小:≤6 cm 36例，＞6 cm 30例，9例缺失;HCC病理分級:Ⅰ、Ⅱ級49例，Ⅲ、Ⅳ級26例;T(原發(fā)灶)分期:T1(孤立腫瘤沒有血管受侵)、T2(孤立腫瘤，有血管受侵或多發(fā)腫瘤直徑≤5 cm)44例，T3(孤立腫瘤或多發(fā)腫瘤侵及門靜脈或肝靜脈主要分支或多發(fā)腫瘤直徑＞5 cm)、T4(腫瘤直接侵及周圍組織，或致膽囊或臟器穿孔)26例，5例缺失;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)69例，有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1)5例，1例缺失;無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)70例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)5例。

1.2 方法

1.2.1 新鮮組織標(biāo)本GTPBP4 mRNA檢測 分別將約0.1 g的HCC及癌旁正常肝組織塊置入已由焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理并加有液氮的研缽內(nèi)，迅速將組織塊碾壓成至粉末狀。依照Invitrogen公司的Tr-izol試劑操作說明書進(jìn)行總RNA抽提。為了測量GTPBP4的mRNA水平，使用Sensiscript RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，使用 SYBR Green PCR Master Mix在ABI Prism 7900序列檢測系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。用于擴(kuò)增GTPBP4的正向引物:5'-TCA GGA TCC GCT AAG CCC CAG GTG GTT-3';反向引物:5'-GGC TCG AGT TAC TGT TTT CGC TTA CG-3'，以GAPDH作為參照物。

1.2.2 組織芯片的GTPBP4免疫組化檢測 GTPBP4抗體稀釋比例為1∶6 000，以磷酸鹽緩沖液(PBS)做陰性對照，免疫組織化學(xué)采用SP法:烤片，68℃，20 min。常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水;二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、100%酒精10 min、100%酒精10 min、95%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min。阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶:3%過氧化氫(H2O2)37℃孵育 10 min，PBS沖洗 3×5 min?？乖迯?fù):置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中用煮沸(95℃，15～20 min)，自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min。正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗。滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min(用PBS代替一抗作陰性對照)。滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。使用HCC組織芯片進(jìn)行實驗對產(chǎn)生的所有GTPBP4抗體表達(dá)的原始實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行判讀，判讀GTPBP4的胞質(zhì)或胞膜染色強(qiáng)度(0/1+/2+/3+)和染色陽性率，癌組織和癌旁組織(上皮)分別判讀。染色強(qiáng)度評分:0分(陰性)，1分(1+)，2分(2+)，3分(3+)。染色陽性率評分:0分(陰性)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。以染色強(qiáng)度評分和染色陽性率評分的乘積為總評分，≤3分為抗體低表達(dá)組，＞3分為抗體高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗、Wilcoxon檢驗，非參數(shù) Mann-Whitney法及 Log-rank檢驗。

2 結(jié)果

2.1 GTPBP4 mRNA在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá) 25例組織標(biāo)本中，HCC組織中GTPBP4 mRNA表達(dá)(8.201±1.228)顯著高于癌旁組織(4.357±1.305，P=0.000 2)。其中HCC組織中表達(dá)上調(diào)18例，變化不明顯4例，表達(dá)下調(diào)3例。

2.2 GTPBP4蛋白在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)在HCC組織芯片中，HCC組織中GTPBP4蛋白表達(dá)水平〔胞質(zhì)(8.100±1.926)、胞膜(1.973±3.594)〕顯著高于癌旁組織(6.567±2.315、0.000±0.000，Z=－4.551、－3.810，均 P=0.000)，見圖 1。

2.3 GTPBP4在HCC中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 病理分級Ⅲ、Ⅳ級患者HCC胞膜GTPBP4表達(dá)水平顯著高于病理分級為Ⅰ、Ⅱ級(P=0.034)。不同年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期患者HCC中GTPBP4表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

圖1 GTPBP4的免疫組化圖片(DAB，×400)

表1 GTPBP4在HCC中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

續(xù)表1 GTPBP4在HCC中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.4 GTPBP4表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后的關(guān)系GTPBP4胞膜高表達(dá)組的生存率顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.049，P=0.014)，見圖 2。

圖2 不同GTPBP4表達(dá)水平HCC患者生存曲線

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，我國每年有約30萬的HCC患者死亡〔7〕。HCC的平均生存期僅為4～6個月〔8〕?；颊叽_診時多數(shù)已進(jìn)入中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會，即使能夠手術(shù)，患者術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率約為50%，5年生存率僅為25%～39%〔9～11〕。HCC 的治療方法主要包括:根治性肝癌切除術(shù)〔12〕、肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)〔13〕、肝癌射頻消融〔14〕、無水乙醇瘤內(nèi)注射術(shù)(PEI)〔15〕、分子靶向藥物(如索拉非尼)〔16〕、肝臟移植等，但總體治療效果均不盡人意。因此，探明HCC發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制，設(shè)計合理化、個性化藥物具有極其深遠(yuǎn)的意義。

人類GTPBP4基因位于染色體10p15.2～15.3，其編碼635個氨基酸，與鼠、兔的GTPBP4基因同源體均保持93%的同源性，其中一個與GTP結(jié)合的超二級結(jié)構(gòu)GYPNVGKS在酵母、鼠類及人類中均保持一致〔17〕。此前，因發(fā)現(xiàn)其在慢性腎臟病中表達(dá)發(fā)生改變，故也曾被稱為慢性腎衰竭基因(CRFG)〔17〕。GTPBP4在核糖體60S的生物發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)，將GTPBP4在釀酒酵母中的同源體敲除后釀酒酵母也隨之停止生長，提示GTPBP4可能與細(xì)胞的生長有關(guān)〔17〕。

本研究表明，GTPBP4的表達(dá)水平與HCC患者的病理分級有關(guān)。而Edmondson-Steiner肝癌分級可顯著提高對HCC患者生存期的預(yù)測效果〔19〕。另外，本研究表明，GTPBP4表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)，并提示GTPBP4為HCC相關(guān)基因，其可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。GTPBP4是否可作為HCC早期診斷的靶蛋白，針對GTPBP4的靶向治療也許能成為HCC治療的一個新靶點。