• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PSMD7基因在人食管鱗癌組織中的表達及影響癌細胞增殖、凋亡的機制研究

    2018-11-19 06:04:56張進忠閆秀明
    中國癌癥雜志 2018年10期
    關鍵詞:蛋白酶體膜電位泛素

    張進忠,石 科,2,郭 丹,楊 亮,閆秀明

    1.河南醫(yī)學高等??茖W校生物化學教研室,河南 鄭州 451191;

    2.鄭州大學細胞生物研究室,河南 鄭州450008

    泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是一個高度復雜的維持蛋白質平衡和細胞活性的體系,通過選擇性周轉目標底物來調節(jié)細胞內許多蛋白的穩(wěn)定,因此UPS參與細胞的多種功能[1],如細胞的增殖、凋亡、血管生成和運動,以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。

    19S蛋白酶體中有4個去泛素化酶亞基,其中26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基7(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7,PSMD7)和26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基14(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14,PSMD14)是JAMM家族的去泛素化酶,位于19S蛋白酶體中[3]。對完整的19S蛋白酶體組織結構學分析表明,在組成蓋子亞復合體的9個亞基中,PSMD7位于中央核心部位,同時和其他4個亞基相結合[4],說明PSMD7在形成19S蛋白酶體結構中起重要作用。PSMD7作為組成19S蛋白酶體結構中的核心成員是否參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,以及其具體的分子機制尚不清楚。前期工作中,我們已經證實了PSMD7在食管鱗癌細胞EC9706和Eca109中呈高表達[5]。因此,本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白質印跡法(Western blot)檢測食管鱗癌及其癌旁正常組織標本中PSMD7的mRNA及蛋白表達情況。在食管鱗癌細胞TE-1中,用慢病毒介導的RNA干擾技術下調PSMD7的表達,觀察細胞增殖及凋亡的變化,建立PSMD7表達量與腫瘤惡性程度之間的關系,為進一步確定PSMD7作為腫瘤治療的靶點提供依據。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑

    TRIzol購自美國Invitrogen公司,RNA逆轉錄試劑盒和SYBR Green購自寶生物工程(大連)有限公司,蛋白提取試劑盒購自美國Solarbio公司,鼠抗人PSMD7單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體和免疫組織化學SP試劑盒購自美國Santa Cruz Biotechnology公司,Western blot相關試劑和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自美國Solarbio公司,CCK-8試劑盒購自美國Beyotime Inst Biotech公司,Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自美國KeyGEN Biotech公司,細胞質和線粒體蛋白質提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    1.1.2 標本來源

    本研究所采用的30例標本均采自河南醫(yī)學高等??茖W校附屬醫(yī)院2016—2017年間未經放療和化療的食管鱗癌手術患者,其中男性17例,女性13 例,年齡35~72歲(平均52.4歲)。手術后立即將新鮮標本進行液氮凍存,每例標本均取癌組織及其癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣5 cm以上)。所有標本均經病理學檢查確診為食管鱗狀細胞癌。

    1.2 方法

    1.2.1 RTFQ-PCR檢測PSMD7的基因表達

    采用TRIzol提取組織標本的總RNA,mRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,分別用PSMD7和GAPDH進行RTFQ-PCR檢測。PSMD7引物:上游5’-CTGTCGTGAGCTGAGATC-3’;下游5’-TCTCAGATTCAAGTGATC-3’。GAPDH引物:上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’;下游5’-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’。反應體系20 μL,在實時熒光定量PCR儀器ABI Q7上設置如下反應條件:94 ℃預變性10 min,94 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸32 s,共30個循環(huán),采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

    1.2.2 Western blot檢測PSMD7蛋白水平

    提取臨床食管鱗癌和癌旁正常食管組織標本的蛋白質,或離心收集細胞并提取總蛋白。檢測細胞質中Cyt C的表達時,首先用細胞質蛋白提取試劑盒提取細胞質總蛋白,二辛可酸法(bicinchonininc acid,BCA)法測定蛋白濃度,每個標本取20 μg蛋白進行SDS-PAGE,電泳結束后進行濕轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉對膜進行4 ℃過夜封閉,然后將膜與一抗(PSMD7單克隆抗體,1∶1 000;GAPDH單克隆抗體,1∶2 000;Cyt C單克隆抗體,1∶2 000;cleaved caspase 3單克隆抗體,1∶2 000;cleaved caspase 9單克隆抗體,1∶2 000;PARP單克隆抗體,1∶2 000;Bax單克隆抗體,1∶2 000;Bcl-2單克隆抗體,1∶2 000)4 ℃溫育過夜,用TBST洗膜3次,每次5 min。再與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)室溫下溫育1 h,TBST洗膜3次,每次5 min,用ECL發(fā)光液進行顯影,計算相對灰度值表示蛋白的相對水平。

    1.2.3 慢病毒介導的shRNA干擾PSMD7的表達與細胞增殖能力和凋亡的檢測

    本研究設計4條動力學參數較優(yōu)的RNA干擾靶點,采用Scramble序列(5’-TTCTCCGAA CGTGTCACGT-3’)作為陰性對照(negative control,NC)。采用HEK-293T細胞進行慢病毒包裝,收集病毒后用polybrene感染人食管鱗癌細胞系TE-1,轉染72 h后用RTFQ-PCR和Western blot檢測PSMD7的表達量。選擇效率最高的RNA干擾靶點進行后續(xù)實驗(表1)。

    將干擾PSMD7表達慢病毒(PSMD7-LV-shRNA)和陰性對照慢病毒(NC-LV-shRNA)感染食管鱗癌細胞TE-1,然后用嘌呤霉素(puromycin)篩選陽性感染細胞,將細胞接種在96孔板上,培養(yǎng)至融合度達80%~90%,每孔加入10 μL CCK-8溶液,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),4 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(D)值,計算抑制PSMD7表達后TE-1增殖能力的變化。

    將慢病毒干擾的陽性細胞接種在6孔板上,培養(yǎng)至融合度達80%~90%,胰酶消化后加入Annexin Ⅴ-PE和7-AAD對細胞進行雙染,采用流式細胞術測定細胞的凋亡情況。

    表 1 PSMD7 shRNA靶點序列Tab. 1 Targeting sequence of PSMD7 shRNA

    1.2.4 細胞線粒體膜電位的測定

    采用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測未感染組、對照組和干擾組的線粒體膜電位。具體方法參照說明書,收集細胞,加入JC-1溶液混勻后置37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min之后離心,離心速率為10 000×g,離心5 min收集細胞,加入2 mL膜電位檢測緩沖溶液,混勻后離心棄上清液,再加入1 mL 膜電位檢測緩沖溶液混勻,采用流式細胞術進行分析。紅色熒光標記正常細胞線粒體,表示膜電位正常,綠色熒光標記凋亡細胞線粒體,表示膜電位降低。

    1.2.5 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,其中兩組之間的比較,每個樣本數據用x±s表示,采用t檢驗分析,PSMD7蛋白表達和臨床病理因素的相關性采用Spearman分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 PSMD7在食管鱗癌組織中的表達

    30例臨床食管鱗癌和癌旁正常食管組織標本中PSMD7的mRNA表達量見圖1A,73.3%(22/30)的標本中PSMD7的mRNA呈現高表達,且PSMD7 mRNA在食管鱗癌和癌旁正常食管組織標本中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明大多數食管鱗癌組織中PSMD7的mRNA表達增高。

    采用Western blot對食管鱗癌標本中PSMD7蛋白的表達進行檢測,結果顯示,70%(21/30)的食管鱗癌標本中PSMD7蛋白呈高表達,與癌旁正常組織相比,PSMD7在食管鱗癌組織中的表達顯著升高(P<0.05,圖1B)。PSMD7蛋白的高表達與淋巴結轉移呈正相關(P<0.05),而與腫瘤分化程度和TNM分期無關(P>0.05,表2)。

    圖 1 食管鱗癌組織中PSMD7的表達Fig. 1 Expression of PSMD7 in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and paracancerous tissues

    表 2 PSMD7蛋白表達與食管鱗癌組織臨床病理特征的相關性Tab. 2 The correlation of PSMD7 expression and ESCC clinical pathological characteristics

    2.2 PSMD7表達水平對人食管鱗癌細胞系TE-1增殖能力和凋亡的影響

    將PSMD7-LV-shRNA和NC-LV-shRNA感染人食管鱗癌細胞系TE-1后,用puromycin篩選陽性感染細胞(圖2A~D)。設計的4種RNA慢病毒干擾序列都能顯著降低PSMD7在TE-1中的表達,其中LV-3的敲減效率最高(圖2E),因此選取LV-3進行后續(xù)實驗。Western blot檢測結果顯示,篩選的PSMD7-LV-shRNA可以顯著降低TE-1細胞中PSMD7蛋白的表達(圖2F、G)。

    圖 2 慢病毒干擾TE-1細胞中PSMD7的表達Fig. 2 Lentiviral-mediated RNAi suppressed mRNA expression of PSMD7 in TE-1 cells

    圖 3 干擾TE-1細胞中PSMD7的表達抑制細胞增殖并促進細胞凋亡Fig. 3 Cell proliferation was decreased and apopotosis was induced when PSMD7 expression was inhibited in TE-1 cells

    通過CCK-8方法檢測干擾PSMD7的表達后TE-1細胞增殖能力的變化,結果顯示,PSMD7干擾組的細胞增殖能力顯著低于對照組(圖3A),說明抑制PSMD7的表達可以降低TE-1細胞的增殖能力。流式細胞術檢測細胞凋亡結果發(fā)現,PSMD7干擾組的細胞凋亡率為28.1%(3次取平均值),顯著高于對照組和未轉染組(圖3B和3C),說明抑制PSMD7的表達可以誘導TE-1細胞的凋亡。

    2.3 干擾PSMD7的表達對TE-1細胞線粒體膜電位和Cyt C的影響

    細胞線粒體膜電位測定結果顯示(圖4A),未處理組TE-1細胞和對照組細胞的綠色熒光的比例為2.8%和3.1%,而PSMD7干擾組為37.5%,說明在TE-1細胞中抑制PSMD7的表達后線粒體的膜電位顯著降低。我們用Western blot進一步檢測了細胞質中Cyt C的表達,結果顯示,與未處理組TE-1細胞和對照組相比,shRNA組細胞質中Cyt C的表達量顯著升高(圖4B和4C),說明抑制PSMD7的表達增加了線粒體膜的通透性,促進Cyt C從線粒體進入細胞質,表明PSMD7可能通過線粒體途徑誘導TE-1細胞凋亡。

    圖 4 干擾PSMD7的表達對TE-1細胞線粒體膜電位和Cyt C的影響Fig. 4 Effects of PSMD7 inhibition on mitochondrial membrane potential and Cyt C expression in TE-1 cells

    2.4 干擾PSMD7的表達對凋亡相關蛋白表達的影響

    抑制PSMD7的表達后,我們檢測了促細胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和PARP的活性降解產物的表達,結果顯示,與對照組相比,干擾組中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達顯著增高,其中cleaved caspase-3增加2.3倍,cleaved caspase-9增加2.0倍(圖5A和5B)。此外,我們檢測了凋亡標志物PARP的表達和裂解情況,PSMD7干擾組的PARP發(fā)生裂解,而未轉染組和對照組未見PARP的裂解(圖5C)。

    促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在細胞內的表達水平與線粒體膜的敏感性密切相關[6]。我們的研究表明,在TE-1細胞中抑制PSMD7的表達使線粒體膜電位增高,膜通透性增強,Cyt C從線粒體釋放進入細胞質,我們進一步檢測了這些變化是否影響B(tài)ax和Bcl-2在細胞內的表達。結果顯示(圖6),干擾PSMD7的表達后Bax的表達增高,Bcl-2的表達下降,與對照組相比,Bax/Bcl-2的比值增加了1倍左右,說明抑制PSMD7通過線粒體依賴的方式誘導細胞凋亡。

    圖 5 干擾PSMD7的表達對凋亡相關蛋白表達的影響Fig. 5 Effects of PSMD7 inhibition on the expression of apopotosis-related protein in TE-1

    圖 6 干擾PSMD7的表達對Bax和Bcl-2表達的影響Fig. 6 Effects of PSMD7 inhibition on the expressions of Bax and Bcl-2 in TE-1

    2.5 Caspase抑制劑對PSMD7誘導TE-1細胞凋亡的影響

    本研究采用Caspase抑制劑z-VAD-fmk處理TE-1細胞抑制Caspase的活性,結果顯示(圖7),z-VAD-fmk使干擾組的細胞活力從53%增加至84%,而抑制PSMD7引起的凋亡細胞從25.5%降為15.2%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),進一步說明抑制PSMD7的表達誘導的細胞凋亡是通過線粒體依賴的方式進行的。

    圖 7 Caspase抑制劑對PSMD7誘導TE-1細胞增殖和凋亡的影響Fig. 7 Effect of caspase inhibitor on cell proliferation and induction of apopotosis after PSMD7 inhibition in TE-1 cells

    3 討 論

    20S蛋白酶體的抑制劑硼替佐米被用來治療多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤,但易產生耐藥,且對實體瘤的治療效果差[7]。研究顯示,19S蛋白酶體中的去泛素化酶參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并可以作為腫瘤治療的靶點,如一些去泛素化酶對腫瘤細胞活力是必需的,通過改變凋亡因子的表達來促進細胞的生存,它們的表達和腫瘤的惡性程度相關[8]。在本研究的前期工作中,我們已經證實PSMD7在食管鱗癌細胞EC9706和Eca109中高表達,且定位發(fā)生改變。慢病毒介導的shRNA干擾PSMD7的表達可以降低食管鱗癌細胞的蛋白酶體活性,使泛素化蛋白在細胞內發(fā)生聚集[5]。本研究以臨床采集的腫瘤標本為研究對象,發(fā)現73.3%的標本中PSMD7的mRNA呈高表達,70%的標本中PSMD7蛋白呈高表達,并且其高表達與淋巴結轉移呈正相關,而與腫瘤的分化程度和TNM分期無關。這些結果表明PSMD7的過表達在食管癌發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用,因此我們對PSMD7在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制進行了深入的研究。

    研究顯示,shRNA干擾PSMD7的表達增加了依賴泛素的GFP報告基因的熒光強度,并導致細胞死亡,和蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞得到的結果類似[9]。本研究用慢病毒介導的RNA干擾來抑制TE-1細胞中PSMD7的表達,發(fā)現使細胞的增殖能力下降并且誘導了細胞的凋亡,這些現象和蛋白酶體抑制劑的作用類似。對PSMD7的結構分析顯示,JAMM結構域是一個非金屬的無等位酶活性的結構[10],說明PSMD7可能不直接水解多泛素化蛋白鏈。然而PSMD7卻同時和其他4個亞基相結合,并位于中央核心部位[4],說明PSMD7在形成19S蛋白酶體lid結構中起重要作用。因此抑制PSMD7的表達有可能影響19S蛋白酶體的組裝,并影響其識別和水解多泛素化鏈的功能。我們的前期研究已表明,抑制食管鱗癌細胞中PSMD7的表達使細胞內泛素化蛋白增加,泛素的熒光增強,并且蛋白酶體的活性降低[5],說明PSMD7參與維持蛋白酶體的正常功能,因此在TE-1細胞中抑制PSMD7的表達得到了類似抑制蛋白酶體活性的結果。

    線粒體是細胞的能量工廠,是參與細胞凋亡的重要細胞器,在凋亡早期即出現結構和功能的改變。在外界因子的刺激下,細胞內首先會發(fā)生線粒體膜通透性增加,體現在膜電位下降,使Cyt C釋放進入細胞質,激活一系列caspase級聯反應,從而引起細胞核發(fā)生凋亡。促凋亡因子Bax可以插入線粒體外膜上誘發(fā)線粒體導致的細胞凋亡,抗凋亡因子Bcl-2通過穩(wěn)定線粒體膜電位的方式使細胞避免進入凋亡通路[11]。本研究抑制PSMD7的表達后觀察到細胞增殖能力下降并誘導細胞凋亡,接著我們研究了這種凋亡是否通過線粒體依賴的方式進行。結果發(fā)現,抑制PSMD7的表達后TE-1細胞的線粒體膜電位顯著降低,細胞質中Cyt C的表達量顯著升高,說明抑制PSMD7的表達增加了線粒體膜的通透性,并促進Cyt C從線粒體進入細胞質。此外,PSMD7干擾組中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達顯著增高,凋亡標志物PARP發(fā)生裂解,而未轉染組和對照組未見PARP的裂解。干擾PSMD7的表達后,Bax的表達增高,Bcl-2的表達下降,與對照組相比,Bax/Bcl-2的比值增加了1倍,說明PSMD7通過線粒體途徑誘導TE-1細胞凋亡。Caspase抑制劑z-VAD-fmk使干擾組的細胞活力恢復,而抑制細胞的凋亡,進一步說明抑制PSMD7的表達誘導的細胞凋亡是通過線粒體依賴的方式進行的。

    本實驗結果表明,PSMD7在食管鱗癌標本中呈高表達,參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步的機制研究表明,抑制PSMD7使TE-1細胞的增殖能力下降,并誘導細胞凋亡,其機制是以線粒體依賴的方式進行的。本研究為進一步確定PSMD7作為食管鱗癌治療的靶點提供了依據。

    猜你喜歡
    蛋白酶體膜電位泛素
    有關動作電位的“4坐標2比較”
    參芪復方對GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關促凋亡蛋白的影響研究
    蛋白酶體激活因子REGγ的腫瘤相關靶蛋白研究進展
    王豐:探究蛋白酶體與疾病之間的秘密
    槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細胞肥大
    蛋白泛素化和類泛素化修飾在植物開花時間調控中的作用
    泛RNA:miRNA是RNA的“泛素”
    泛素結合結構域與泛素化信號的識別
    魚藤酮誘導PC12細胞凋亡及線粒體膜電位變化
    SCF E3泛素化連接酶的研究進展
    日韩人妻高清精品专区| 亚洲天堂av无毛| 国产一区有黄有色的免费视频| a级毛片黄视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产 一区精品| 91aial.com中文字幕在线观看| 少妇高潮的动态图| 考比视频在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 精品人妻一区二区三区麻豆| 嘟嘟电影网在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 女人精品久久久久毛片| 伊人亚洲综合成人网| 女人久久www免费人成看片| 国产日韩欧美在线精品| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲怡红院男人天堂| 岛国毛片在线播放| 亚洲丝袜综合中文字幕| 18禁观看日本| 国产成人免费无遮挡视频| 大香蕉久久成人网| 全区人妻精品视频| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 丝袜脚勾引网站| 亚洲色图综合在线观看| 一区在线观看完整版| 18在线观看网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 91久久精品电影网| 伦理电影大哥的女人| 国产在线视频一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| av黄色大香蕉| 欧美成人午夜免费资源| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美日韩av久久| 久久青草综合色| 国产精品一区二区在线不卡| 99热网站在线观看| www.色视频.com| 一区二区三区精品91| 成人毛片a级毛片在线播放| 在线精品无人区一区二区三| 97超碰精品成人国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产精品.久久久| 蜜桃在线观看..| 免费人成在线观看视频色| 乱码一卡2卡4卡精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 午夜福利影视在线免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产片内射在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 最黄视频免费看| 视频区图区小说| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产 一区精品| 一本色道久久久久久精品综合| 一级毛片 在线播放| 国产一区二区在线观看av| 亚洲怡红院男人天堂| 国产 一区精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩伦理黄色片| 国产男人的电影天堂91| 桃花免费在线播放| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲美女视频黄频| 欧美bdsm另类| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99久国产av精品国产电影| 高清毛片免费看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲五月色婷婷综合| 精品人妻熟女av久视频| 中文字幕免费在线视频6| 成人综合一区亚洲| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 99热网站在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99久久综合免费| 在线免费观看不下载黄p国产| 特大巨黑吊av在线直播| 久热这里只有精品99| 欧美最新免费一区二区三区| freevideosex欧美| 亚洲av男天堂| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产最新在线播放| 婷婷色av中文字幕| 美女中出高潮动态图| av专区在线播放| 成人无遮挡网站| 午夜91福利影院| 日本欧美国产在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 精品少妇内射三级| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av国产精品久久久久影院| 啦啦啦在线观看免费高清www| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩中文字幕视频在线看片| 一级片'在线观看视频| 国产精品人妻久久久影院| av天堂久久9| 久久午夜福利片| 久久韩国三级中文字幕| 高清不卡的av网站| 久久99热这里只频精品6学生| 中国国产av一级| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品一区二区免费观看| 99热国产这里只有精品6| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 精品亚洲成国产av| 国产精品久久久久久精品古装| 青春草国产在线视频| 免费黄网站久久成人精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av天堂久久9| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久国内精品自在自线图片| 亚洲不卡免费看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日本色播在线视频| www.色视频.com| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国精品久久久久久国模美| 三级国产精品欧美在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av一本久久久久| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产精品偷伦视频观看了| 精品国产一区二区久久| 各种免费的搞黄视频| 久久久精品94久久精品| 日韩免费高清中文字幕av| 国产成人aa在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 自线自在国产av| 青春草视频在线免费观看| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久亚洲精品成人影院| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日韩中字成人| 久久久久久伊人网av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美性感艳星| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产亚洲一区二区精品| 成人综合一区亚洲| 99国产精品免费福利视频| 黑丝袜美女国产一区| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品一国产av| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲成人手机| 曰老女人黄片| 国产一级毛片在线| tube8黄色片| kizo精华| 亚洲国产日韩一区二区| 高清午夜精品一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 极品人妻少妇av视频| 大码成人一级视频| 久久ye,这里只有精品| 久久韩国三级中文字幕| 免费日韩欧美在线观看| 51国产日韩欧美| 自线自在国产av| 日韩欧美一区视频在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲经典国产精华液单| 久久免费观看电影| 精品久久久久久久久亚洲| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国精品久久久久久国模美| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜精品国产一区二区电影| 男人添女人高潮全过程视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久99精品国语久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 99久久综合免费| 曰老女人黄片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| h视频一区二区三区| 久久女婷五月综合色啪小说| 2022亚洲国产成人精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 视频中文字幕在线观看| 高清欧美精品videossex| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 日韩 亚洲 欧美在线| 高清毛片免费看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 亚洲av中文av极速乱| 少妇人妻久久综合中文| 丰满乱子伦码专区| 高清欧美精品videossex| 飞空精品影院首页| 日韩一区二区视频免费看| 国产欧美亚洲国产| 午夜日本视频在线| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久久久人妻| 亚洲人成77777在线视频| 国产一区二区三区av在线| av免费在线看不卡| 国产综合精华液| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久久久久久久久大奶| 97超视频在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲中文av在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 最近的中文字幕免费完整| 在线观看美女被高潮喷水网站| 大香蕉97超碰在线| 一本大道久久a久久精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 9色porny在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 高清在线视频一区二区三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 插逼视频在线观看| 国产精品无大码| 亚洲av福利一区| videossex国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品久久久久成人av| 成年人午夜在线观看视频| 一级黄片播放器| 午夜福利视频在线观看免费| 国产毛片在线视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产伦精品一区二区三区视频9| 综合色丁香网| 一级黄片播放器| 午夜影院在线不卡| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成人手机av| 日韩av免费高清视频| 精品国产国语对白av| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 永久网站在线| av免费在线看不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 99久久人妻综合| 欧美+日韩+精品| 18在线观看网站| 一边亲一边摸免费视频| 国产 精品1| 精品久久久噜噜| 国产成人精品福利久久| 黄片无遮挡物在线观看| 久久ye,这里只有精品| 水蜜桃什么品种好| 国产成人精品一,二区| 国产av精品麻豆| 欧美bdsm另类| 最近中文字幕高清免费大全6| 麻豆乱淫一区二区| 中文字幕久久专区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产一区二区三区av在线| 丰满乱子伦码专区| 国产片特级美女逼逼视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美bdsm另类| 午夜免费鲁丝| 国产视频内射| 亚洲国产精品999| av在线观看视频网站免费| 人人澡人人妻人| 成年av动漫网址| 国产在线视频一区二区| 国产黄频视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 午夜激情av网站| 免费黄网站久久成人精品| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲,欧美,日韩| 成人亚洲精品一区在线观看| 99热国产这里只有精品6| 国产黄片视频在线免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 最近中文字幕高清免费大全6| 一个人免费看片子| 久久99一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 乱人伦中国视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 22中文网久久字幕| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 男人爽女人下面视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男的添女的下面高潮视频| 在线观看三级黄色| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美最新免费一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲国产最新在线播放| 少妇精品久久久久久久| 中文天堂在线官网| 久久ye,这里只有精品| 另类精品久久| 伦理电影大哥的女人| 一级毛片 在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 欧美人与善性xxx| 亚洲伊人久久精品综合| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜福利,免费看| 99热国产这里只有精品6| 丰满少妇做爰视频| 国产免费又黄又爽又色| 日本av免费视频播放| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久久国产精品人妻一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲成色77777| 精品国产一区二区久久| 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 亚洲美女视频黄频| 日本欧美国产在线视频| 午夜视频国产福利| av免费观看日本| 国内精品宾馆在线| 亚洲久久久国产精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品久久久精品久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 美女中出高潮动态图| 日韩av不卡免费在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 嫩草影院入口| 亚洲欧美色中文字幕在线| 91国产中文字幕| 精品久久久精品久久久| 国产色婷婷99| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲国产精品一区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产男女超爽视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 高清黄色对白视频在线免费看| 中文字幕最新亚洲高清| 老熟女久久久| 男女免费视频国产| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一级a做视频免费观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 男女边摸边吃奶| 日韩成人av中文字幕在线观看| 99久久人妻综合| 久久久久久久久久久久大奶| 久久 成人 亚洲| 中文字幕久久专区| 欧美日韩视频精品一区| 免费观看的影片在线观看| 18+在线观看网站| 99热国产这里只有精品6| 女性被躁到高潮视频| 99国产精品免费福利视频| 日本vs欧美在线观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 色94色欧美一区二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品久久久久久精品古装| 熟女电影av网| 黄片播放在线免费| av在线app专区| 一区二区三区精品91| 一级毛片我不卡| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成人免费观看mmmm| 欧美精品亚洲一区二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 中国三级夫妇交换| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲成人av在线免费| www.色视频.com| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日本爱情动作片www.在线观看| av黄色大香蕉| 最新的欧美精品一区二区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 插逼视频在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 97在线人人人人妻| 两个人的视频大全免费| 国产成人a∨麻豆精品| 99久久精品一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品一二三区在线看| 色94色欧美一区二区| 有码 亚洲区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 激情五月婷婷亚洲| 久热久热在线精品观看| 制服丝袜香蕉在线| xxxhd国产人妻xxx| 国产淫语在线视频| 日日撸夜夜添| 91精品国产九色| 国产免费一级a男人的天堂| 日本av手机在线免费观看| 免费少妇av软件| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品人妻久久久久久| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产深夜福利视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| av在线播放精品| 久热这里只有精品99| 日本vs欧美在线观看视频| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 精品国产国语对白av| 国产成人freesex在线| 97在线视频观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 只有这里有精品99| 精品人妻熟女av久视频| 久久国产精品大桥未久av| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产精品不卡视频一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 美女大奶头黄色视频| 午夜91福利影院| 大香蕉久久网| 丰满迷人的少妇在线观看| h视频一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 999精品在线视频| 两个人的视频大全免费| videossex国产| 国产毛片在线视频| 国国产精品蜜臀av免费| 国产高清三级在线| 亚洲美女视频黄频| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一本大道久久a久久精品| 久久久国产精品麻豆| 国产综合精华液| h视频一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 香蕉精品网在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品人妻熟女av久视频| 精品熟女少妇av免费看| 精品久久久精品久久久| 国产成人精品在线电影| 国产综合精华液| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本wwww免费看| 少妇熟女欧美另类| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久久噜噜| 制服诱惑二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久免费观看电影| 午夜激情av网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 丰满少妇做爰视频| 少妇高潮的动态图| 久久99热这里只频精品6学生| 91精品三级在线观看| 久久久精品94久久精品| 精品视频人人做人人爽| 大码成人一级视频| 新久久久久国产一级毛片| 视频区图区小说| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久热精品热| a级毛片黄视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av电影中文网址| 欧美最新免费一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99国产精品免费福利视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 18+在线观看网站| 一级毛片电影观看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 熟女av电影| 国产精品一区二区在线不卡| 久热这里只有精品99| 午夜久久久在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 欧美bdsm另类| 亚洲不卡免费看| 我的女老师完整版在线观看| 伊人久久国产一区二区| 亚洲国产精品专区欧美| 97在线人人人人妻| xxx大片免费视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 人成视频在线观看免费观看| 女性被躁到高潮视频| 欧美精品一区二区大全| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 永久网站在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩一本色道免费dvd| 最近的中文字幕免费完整| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 伦精品一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 高清在线视频一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 如何舔出高潮| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 内地一区二区视频在线| 草草在线视频免费看| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲精品色激情综合| 欧美97在线视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产毛片在线视频| 国产黄片视频在线免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一本久久精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 熟女人妻精品中文字幕| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 成人国产麻豆网|