張進忠,石 科,2,郭 丹,楊 亮,閆秀明
1.河南醫(yī)學高等??茖W校生物化學教研室,河南 鄭州 451191;
2.鄭州大學細胞生物研究室,河南 鄭州450008
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是一個高度復雜的維持蛋白質平衡和細胞活性的體系,通過選擇性周轉目標底物來調節(jié)細胞內許多蛋白的穩(wěn)定,因此UPS參與細胞的多種功能[1],如細胞的增殖、凋亡、血管生成和運動,以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。
19S蛋白酶體中有4個去泛素化酶亞基,其中26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基7(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7,PSMD7)和26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基14(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14,PSMD14)是JAMM家族的去泛素化酶,位于19S蛋白酶體中[3]。對完整的19S蛋白酶體組織結構學分析表明,在組成蓋子亞復合體的9個亞基中,PSMD7位于中央核心部位,同時和其他4個亞基相結合[4],說明PSMD7在形成19S蛋白酶體結構中起重要作用。PSMD7作為組成19S蛋白酶體結構中的核心成員是否參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,以及其具體的分子機制尚不清楚。前期工作中,我們已經證實了PSMD7在食管鱗癌細胞EC9706和Eca109中呈高表達[5]。因此,本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白質印跡法(Western blot)檢測食管鱗癌及其癌旁正常組織標本中PSMD7的mRNA及蛋白表達情況。在食管鱗癌細胞TE-1中,用慢病毒介導的RNA干擾技術下調PSMD7的表達,觀察細胞增殖及凋亡的變化,建立PSMD7表達量與腫瘤惡性程度之間的關系,為進一步確定PSMD7作為腫瘤治療的靶點提供依據。
1.1.1 主要試劑
TRIzol購自美國Invitrogen公司,RNA逆轉錄試劑盒和SYBR Green購自寶生物工程(大連)有限公司,蛋白提取試劑盒購自美國Solarbio公司,鼠抗人PSMD7單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體和免疫組織化學SP試劑盒購自美國Santa Cruz Biotechnology公司,Western blot相關試劑和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自美國Solarbio公司,CCK-8試劑盒購自美國Beyotime Inst Biotech公司,Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自美國KeyGEN Biotech公司,細胞質和線粒體蛋白質提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.1.2 標本來源
本研究所采用的30例標本均采自河南醫(yī)學高等??茖W校附屬醫(yī)院2016—2017年間未經放療和化療的食管鱗癌手術患者,其中男性17例,女性13 例,年齡35~72歲(平均52.4歲)。手術后立即將新鮮標本進行液氮凍存,每例標本均取癌組織及其癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣5 cm以上)。所有標本均經病理學檢查確診為食管鱗狀細胞癌。
1.2.1 RTFQ-PCR檢測PSMD7的基因表達
采用TRIzol提取組織標本的總RNA,mRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,分別用PSMD7和GAPDH進行RTFQ-PCR檢測。PSMD7引物:上游5’-CTGTCGTGAGCTGAGATC-3’;下游5’-TCTCAGATTCAAGTGATC-3’。GAPDH引物:上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’;下游5’-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’。反應體系20 μL,在實時熒光定量PCR儀器ABI Q7上設置如下反應條件:94 ℃預變性10 min,94 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸32 s,共30個循環(huán),采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。
1.2.2 Western blot檢測PSMD7蛋白水平
提取臨床食管鱗癌和癌旁正常食管組織標本的蛋白質,或離心收集細胞并提取總蛋白。檢測細胞質中Cyt C的表達時,首先用細胞質蛋白提取試劑盒提取細胞質總蛋白,二辛可酸法(bicinchonininc acid,BCA)法測定蛋白濃度,每個標本取20 μg蛋白進行SDS-PAGE,電泳結束后進行濕轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉對膜進行4 ℃過夜封閉,然后將膜與一抗(PSMD7單克隆抗體,1∶1 000;GAPDH單克隆抗體,1∶2 000;Cyt C單克隆抗體,1∶2 000;cleaved caspase 3單克隆抗體,1∶2 000;cleaved caspase 9單克隆抗體,1∶2 000;PARP單克隆抗體,1∶2 000;Bax單克隆抗體,1∶2 000;Bcl-2單克隆抗體,1∶2 000)4 ℃溫育過夜,用TBST洗膜3次,每次5 min。再與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)室溫下溫育1 h,TBST洗膜3次,每次5 min,用ECL發(fā)光液進行顯影,計算相對灰度值表示蛋白的相對水平。
1.2.3 慢病毒介導的shRNA干擾PSMD7的表達與細胞增殖能力和凋亡的檢測
本研究設計4條動力學參數較優(yōu)的RNA干擾靶點,采用Scramble序列(5’-TTCTCCGAA CGTGTCACGT-3’)作為陰性對照(negative control,NC)。采用HEK-293T細胞進行慢病毒包裝,收集病毒后用polybrene感染人食管鱗癌細胞系TE-1,轉染72 h后用RTFQ-PCR和Western blot檢測PSMD7的表達量。選擇效率最高的RNA干擾靶點進行后續(xù)實驗(表1)。
將干擾PSMD7表達慢病毒(PSMD7-LV-shRNA)和陰性對照慢病毒(NC-LV-shRNA)感染食管鱗癌細胞TE-1,然后用嘌呤霉素(puromycin)篩選陽性感染細胞,將細胞接種在96孔板上,培養(yǎng)至融合度達80%~90%,每孔加入10 μL CCK-8溶液,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),4 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(D)值,計算抑制PSMD7表達后TE-1增殖能力的變化。
將慢病毒干擾的陽性細胞接種在6孔板上,培養(yǎng)至融合度達80%~90%,胰酶消化后加入Annexin Ⅴ-PE和7-AAD對細胞進行雙染,采用流式細胞術測定細胞的凋亡情況。
表 1 PSMD7 shRNA靶點序列Tab. 1 Targeting sequence of PSMD7 shRNA
1.2.4 細胞線粒體膜電位的測定
采用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測未感染組、對照組和干擾組的線粒體膜電位。具體方法參照說明書,收集細胞,加入JC-1溶液混勻后置37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min之后離心,離心速率為10 000×g,離心5 min收集細胞,加入2 mL膜電位檢測緩沖溶液,混勻后離心棄上清液,再加入1 mL 膜電位檢測緩沖溶液混勻,采用流式細胞術進行分析。紅色熒光標記正常細胞線粒體,表示膜電位正常,綠色熒光標記凋亡細胞線粒體,表示膜電位降低。
1.2.5 統(tǒng)計學處理
采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,其中兩組之間的比較,每個樣本數據用x±s表示,采用t檢驗分析,PSMD7蛋白表達和臨床病理因素的相關性采用Spearman分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
30例臨床食管鱗癌和癌旁正常食管組織標本中PSMD7的mRNA表達量見圖1A,73.3%(22/30)的標本中PSMD7的mRNA呈現高表達,且PSMD7 mRNA在食管鱗癌和癌旁正常食管組織標本中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明大多數食管鱗癌組織中PSMD7的mRNA表達增高。
采用Western blot對食管鱗癌標本中PSMD7蛋白的表達進行檢測,結果顯示,70%(21/30)的食管鱗癌標本中PSMD7蛋白呈高表達,與癌旁正常組織相比,PSMD7在食管鱗癌組織中的表達顯著升高(P<0.05,圖1B)。PSMD7蛋白的高表達與淋巴結轉移呈正相關(P<0.05),而與腫瘤分化程度和TNM分期無關(P>0.05,表2)。
圖 1 食管鱗癌組織中PSMD7的表達Fig. 1 Expression of PSMD7 in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and paracancerous tissues
表 2 PSMD7蛋白表達與食管鱗癌組織臨床病理特征的相關性Tab. 2 The correlation of PSMD7 expression and ESCC clinical pathological characteristics
將PSMD7-LV-shRNA和NC-LV-shRNA感染人食管鱗癌細胞系TE-1后,用puromycin篩選陽性感染細胞(圖2A~D)。設計的4種RNA慢病毒干擾序列都能顯著降低PSMD7在TE-1中的表達,其中LV-3的敲減效率最高(圖2E),因此選取LV-3進行后續(xù)實驗。Western blot檢測結果顯示,篩選的PSMD7-LV-shRNA可以顯著降低TE-1細胞中PSMD7蛋白的表達(圖2F、G)。
圖 2 慢病毒干擾TE-1細胞中PSMD7的表達Fig. 2 Lentiviral-mediated RNAi suppressed mRNA expression of PSMD7 in TE-1 cells
圖 3 干擾TE-1細胞中PSMD7的表達抑制細胞增殖并促進細胞凋亡Fig. 3 Cell proliferation was decreased and apopotosis was induced when PSMD7 expression was inhibited in TE-1 cells
通過CCK-8方法檢測干擾PSMD7的表達后TE-1細胞增殖能力的變化,結果顯示,PSMD7干擾組的細胞增殖能力顯著低于對照組(圖3A),說明抑制PSMD7的表達可以降低TE-1細胞的增殖能力。流式細胞術檢測細胞凋亡結果發(fā)現,PSMD7干擾組的細胞凋亡率為28.1%(3次取平均值),顯著高于對照組和未轉染組(圖3B和3C),說明抑制PSMD7的表達可以誘導TE-1細胞的凋亡。
細胞線粒體膜電位測定結果顯示(圖4A),未處理組TE-1細胞和對照組細胞的綠色熒光的比例為2.8%和3.1%,而PSMD7干擾組為37.5%,說明在TE-1細胞中抑制PSMD7的表達后線粒體的膜電位顯著降低。我們用Western blot進一步檢測了細胞質中Cyt C的表達,結果顯示,與未處理組TE-1細胞和對照組相比,shRNA組細胞質中Cyt C的表達量顯著升高(圖4B和4C),說明抑制PSMD7的表達增加了線粒體膜的通透性,促進Cyt C從線粒體進入細胞質,表明PSMD7可能通過線粒體途徑誘導TE-1細胞凋亡。
圖 4 干擾PSMD7的表達對TE-1細胞線粒體膜電位和Cyt C的影響Fig. 4 Effects of PSMD7 inhibition on mitochondrial membrane potential and Cyt C expression in TE-1 cells
抑制PSMD7的表達后,我們檢測了促細胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和PARP的活性降解產物的表達,結果顯示,與對照組相比,干擾組中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達顯著增高,其中cleaved caspase-3增加2.3倍,cleaved caspase-9增加2.0倍(圖5A和5B)。此外,我們檢測了凋亡標志物PARP的表達和裂解情況,PSMD7干擾組的PARP發(fā)生裂解,而未轉染組和對照組未見PARP的裂解(圖5C)。
促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在細胞內的表達水平與線粒體膜的敏感性密切相關[6]。我們的研究表明,在TE-1細胞中抑制PSMD7的表達使線粒體膜電位增高,膜通透性增強,Cyt C從線粒體釋放進入細胞質,我們進一步檢測了這些變化是否影響B(tài)ax和Bcl-2在細胞內的表達。結果顯示(圖6),干擾PSMD7的表達后Bax的表達增高,Bcl-2的表達下降,與對照組相比,Bax/Bcl-2的比值增加了1倍左右,說明抑制PSMD7通過線粒體依賴的方式誘導細胞凋亡。
圖 5 干擾PSMD7的表達對凋亡相關蛋白表達的影響Fig. 5 Effects of PSMD7 inhibition on the expression of apopotosis-related protein in TE-1
圖 6 干擾PSMD7的表達對Bax和Bcl-2表達的影響Fig. 6 Effects of PSMD7 inhibition on the expressions of Bax and Bcl-2 in TE-1
本研究采用Caspase抑制劑z-VAD-fmk處理TE-1細胞抑制Caspase的活性,結果顯示(圖7),z-VAD-fmk使干擾組的細胞活力從53%增加至84%,而抑制PSMD7引起的凋亡細胞從25.5%降為15.2%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),進一步說明抑制PSMD7的表達誘導的細胞凋亡是通過線粒體依賴的方式進行的。
圖 7 Caspase抑制劑對PSMD7誘導TE-1細胞增殖和凋亡的影響Fig. 7 Effect of caspase inhibitor on cell proliferation and induction of apopotosis after PSMD7 inhibition in TE-1 cells
20S蛋白酶體的抑制劑硼替佐米被用來治療多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤,但易產生耐藥,且對實體瘤的治療效果差[7]。研究顯示,19S蛋白酶體中的去泛素化酶參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并可以作為腫瘤治療的靶點,如一些去泛素化酶對腫瘤細胞活力是必需的,通過改變凋亡因子的表達來促進細胞的生存,它們的表達和腫瘤的惡性程度相關[8]。在本研究的前期工作中,我們已經證實PSMD7在食管鱗癌細胞EC9706和Eca109中高表達,且定位發(fā)生改變。慢病毒介導的shRNA干擾PSMD7的表達可以降低食管鱗癌細胞的蛋白酶體活性,使泛素化蛋白在細胞內發(fā)生聚集[5]。本研究以臨床采集的腫瘤標本為研究對象,發(fā)現73.3%的標本中PSMD7的mRNA呈高表達,70%的標本中PSMD7蛋白呈高表達,并且其高表達與淋巴結轉移呈正相關,而與腫瘤的分化程度和TNM分期無關。這些結果表明PSMD7的過表達在食管癌發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用,因此我們對PSMD7在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制進行了深入的研究。
研究顯示,shRNA干擾PSMD7的表達增加了依賴泛素的GFP報告基因的熒光強度,并導致細胞死亡,和蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞得到的結果類似[9]。本研究用慢病毒介導的RNA干擾來抑制TE-1細胞中PSMD7的表達,發(fā)現使細胞的增殖能力下降并且誘導了細胞的凋亡,這些現象和蛋白酶體抑制劑的作用類似。對PSMD7的結構分析顯示,JAMM結構域是一個非金屬的無等位酶活性的結構[10],說明PSMD7可能不直接水解多泛素化蛋白鏈。然而PSMD7卻同時和其他4個亞基相結合,并位于中央核心部位[4],說明PSMD7在形成19S蛋白酶體lid結構中起重要作用。因此抑制PSMD7的表達有可能影響19S蛋白酶體的組裝,并影響其識別和水解多泛素化鏈的功能。我們的前期研究已表明,抑制食管鱗癌細胞中PSMD7的表達使細胞內泛素化蛋白增加,泛素的熒光增強,并且蛋白酶體的活性降低[5],說明PSMD7參與維持蛋白酶體的正常功能,因此在TE-1細胞中抑制PSMD7的表達得到了類似抑制蛋白酶體活性的結果。
線粒體是細胞的能量工廠,是參與細胞凋亡的重要細胞器,在凋亡早期即出現結構和功能的改變。在外界因子的刺激下,細胞內首先會發(fā)生線粒體膜通透性增加,體現在膜電位下降,使Cyt C釋放進入細胞質,激活一系列caspase級聯反應,從而引起細胞核發(fā)生凋亡。促凋亡因子Bax可以插入線粒體外膜上誘發(fā)線粒體導致的細胞凋亡,抗凋亡因子Bcl-2通過穩(wěn)定線粒體膜電位的方式使細胞避免進入凋亡通路[11]。本研究抑制PSMD7的表達后觀察到細胞增殖能力下降并誘導細胞凋亡,接著我們研究了這種凋亡是否通過線粒體依賴的方式進行。結果發(fā)現,抑制PSMD7的表達后TE-1細胞的線粒體膜電位顯著降低,細胞質中Cyt C的表達量顯著升高,說明抑制PSMD7的表達增加了線粒體膜的通透性,并促進Cyt C從線粒體進入細胞質。此外,PSMD7干擾組中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達顯著增高,凋亡標志物PARP發(fā)生裂解,而未轉染組和對照組未見PARP的裂解。干擾PSMD7的表達后,Bax的表達增高,Bcl-2的表達下降,與對照組相比,Bax/Bcl-2的比值增加了1倍,說明PSMD7通過線粒體途徑誘導TE-1細胞凋亡。Caspase抑制劑z-VAD-fmk使干擾組的細胞活力恢復,而抑制細胞的凋亡,進一步說明抑制PSMD7的表達誘導的細胞凋亡是通過線粒體依賴的方式進行的。
本實驗結果表明,PSMD7在食管鱗癌標本中呈高表達,參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步的機制研究表明,抑制PSMD7使TE-1細胞的增殖能力下降,并誘導細胞凋亡,其機制是以線粒體依賴的方式進行的。本研究為進一步確定PSMD7作為食管鱗癌治療的靶點提供了依據。