5-氮雜胞苷可通過抑制Notch1通路誘導食管癌細胞凋亡

徐 瞳，胡麗娜，郭顯智，潘健健，余明華

1.復旦大學附屬浦東醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 201399；

2.復旦大學附屬浦東醫(yī)院全科醫(yī)學科，上海 201399

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高。食管癌每年在發(fā)展中國家的新發(fā)病率為4.6%，在所有惡性腫瘤中排第7位；除日本和韓國外，全球范圍內(nèi)其5年生存率為10%～30%［1］。中晚期食管癌預后較差，術前新輔助或術后輔助放化療不僅可明顯提高中晚期食管癌的總生存率，還能有效降低局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移［2-3］。因此，有效化療藥物的探索對改善食管癌患者的生存和預后具有重要意義。Notch1信號通路參與細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞周期調(diào)控等多種重要生理活動并在食管癌中存在異?；罨?，該通路的活化與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關［4］。在食管鱗狀細胞中該通路可參與細胞周期、衰老和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程；在食管腺癌中可驅(qū)動腫瘤細胞干性和促進腫瘤發(fā)生［5］。5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-azaC）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其化學成分是一種胞嘧啶核苷類似物，可以整合到DNA和RNA中，抑制DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成［6］，在臨床中已用于治療白血病、乳腺癌、腸癌及黑色素瘤，但其具體抗癌機制尚未完全明確。

5-azaC在食管癌中的作用及其作用機制尚不明確，又因Notch1通路在食管癌形成過程中有重要的促癌作用。因此，本研究選取了食管鱗癌細胞株TE-1及食管腺癌細胞株OE33，觀察5-azaC處理后食管癌細胞的凋亡和增殖情況，以及Notch1通路相關分子的變化，以探索5-azaC抗食管癌的潛能及其發(fā)揮作用可能涉及的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細胞株

人食管鱗癌細胞系TE-1與人食管腺癌細胞株OE33購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）；DMEM/high glucose細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清（04-001-1ACS）購自以色列Biological Industries公司；5-azaC（A2385-100MG）購自美國Sigma公司，純度大于等于98%；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學研究所；cDNA反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）分別采用德國Qiagen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（205311）及SYBR Green PCR試劑盒（208054）；細胞凋亡流式細胞學檢測試劑盒Annexin V PE 凋亡檢測試劑盒100st（559763）購自美國BD公司；兔抗人Notch1（D1E11）XP（3608）、兔抗人Cleaved Notch1-Val 1744（D3B8)（4147）及羊抗兔IgG二抗均購自美國CST公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將TE-1及OE33細胞置于含10%胎牛血清的DMEM/high glucose完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用細胞計數(shù)儀計數(shù)，按需接種于培養(yǎng)板。待貼壁后令細胞饑餓12 h，再將對照組培養(yǎng)基更換為含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，處理組加入終濃度為50 μmol /L 5-azaC且含5%胎牛血清的培養(yǎng)基［7-8］。

1.3 CCK-8檢測細胞毒性

將TE-1及OE33細胞均以0.8×104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設3個復孔，每孔100 μL含或不含5-azaC的培養(yǎng)基。24 h后加入CCK-8，以無細胞的培養(yǎng)基為空白對照調(diào)零。2 h后450 nm處讀取吸光度（D）值，并換算為細胞數(shù)，細胞存活率（%）=（處理組）/（對照組）×100。

1.4 細胞凋亡實驗

采用Annexin Ⅴ PE法檢測細胞凋亡情況。采用上述方法處理細胞24 h后收集細胞，按說明書操作后采用流式細胞術進行檢測。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

采用上述方法處理細胞24 h后，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液提取蛋白并定量。取總量20 μg的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗與抗體稀釋液以1∶1 000濃度配置，4 ℃垂直搖床溫育過夜，1∶3 000濃度二抗室溫溫育1 h后顯影。GAPDH為內(nèi)參，用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算目的蛋白的相對水平。

1.6 RTFQ-PCR檢測

采用TRIzol-氯仿-異丙醇法提取處理后的總RNA，按照產(chǎn)品操作說明，以20 μL體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTFQ-PCR的反應條件為95 ℃，2 min預變性，95 ℃ 15 s，60 ℃35 s，共40個循環(huán)。引物序列GAPDH上游為5’-TGCCCTCAACGACCACTTT-3’，GAPDH下游為5’-GGTCCAGGGGTCTTACTCC TT-3’；Notch1上游為5’-TGCCGAACCAAT ACAACCCTC-3’，Notch1下游為5’-TGG TAGCTCATCATCTGGGACA-3’。GAPDH的Ct值為參照，2-ΔΔCt計算mRNA表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用Prism 7.0a軟件進行統(tǒng)計學分析。5-azaC處理后Notch1 mRNA表達變化以ΔΔCt作為統(tǒng)計量，計量資料實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 5-azaC抑制TE-1及OE33細胞增殖

CCK-8結果顯示，藥物處理24 h后，兩種細胞的處理組與對照組細胞數(shù)量均顯著減少（圖1）：因計算時使用對照組細胞數(shù)量為除數(shù)，故TE-1及OE33對照組細胞存活率均為100%；TE-1細胞5-azaC處理的細胞存活率為（66.25±3.42）%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），而OE33細胞5-azaC處理的細胞存活率為（23.63±0.93）%，與對照組相比，差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。

圖 1 5-azaC抑制TE-1及OE33食管癌細胞株的增殖Fig. 1 5-azaC inhibited the proliferation of TE-1 and OE33 esophageal cancer cell lines

2.2 5-azaC誘導TE-1及OE33細胞凋亡

應用Annexin Ⅴ PE法顯示，處理組的兩種細胞凋亡群體百分比均升高，TE-1細胞對照組凋亡細胞百分比為（10.43±0.44）%，5-azaC處理組凋亡細胞百分比為(16.31±2.04)%；OE33細胞對照組和5-azaC處理組凋亡細胞百分比分別為（11.03±2.79）%和（58.50±5.04）%，兩種細胞處理組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（TE-1：P＜0.05；OE33：P＜0.01，圖2）。

此外，Western blot檢測了抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-XL（B-cell lymphoma-extra large，BCL-XL）的表達變化（圖3），5-azaC處理后兩種細胞BCL-XL的表達下降（TE-1對照組為1.647±0.191，TE-1 5-azaC組為1.020±0.142，P＜0.05；OE33對照組為1.188±0.065，OE33 5-azaC組為0.409±0.075，P＜0.000 1）。

倒置顯微鏡（×200）可以觀察到5-azaC處理后細胞形態(tài)也發(fā)生了一系列凋亡改變：細胞膜不清，細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，核膜碎裂及細胞核崩解等（圖4）。

圖 2 Annexin V PE法檢測對照組與處理組使用5-azaC 24 h后細胞凋亡情況Fig. 2 Apoptotic rates of control groups and 5-azaC treated group detected by Annexin Ⅴ PE

圖 3 使用5-azaC處理TE-1及OE33細胞后，Western blot檢測到促凋亡蛋白BCL-XL表達減少Fig. 3 Anti-apoptosis protein BCL-XL was downregulated by treatment of 5-azaC in TE-1 and OE33 cell lines

圖 4 5-azaC處理后TE-1及OE33細胞形態(tài)發(fā)生變化Fig. 4 Cells treated with 5-azaC showed went on morphological changes

2.3 5-azaC對Notch1信號通路在轉(zhuǎn)錄層面的影響

RTFQ-PCR結果顯示，5-azaC處理24 h后TE-1與OE33的Notch1 mRNA相對表達水平分別為2.707±0.440（P＜0.01）和2.367±0.411（P＜0.01），較對照組顯著提高（圖5）。

2.4 5-azaC可能部分阻斷Notch1受體細胞內(nèi)分裂

使用Western blot檢測兩種細胞系中Notch1蛋白和其Notch細胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD）的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)兩種細胞系中處理組與對照組Notch1表達基本相同（TE-1 對照組為0.989±0.059，TE-1 5-azaC組為0.996±0.080，P＞0.05；OE33對照組為1.358±0.012，OE33 5-azaC組為1.171±0.164，P＞0.05），而NICD的表達均被下調(diào)（TE-1對照組為0.853±0.017，TE-1 5-azaC組為0.551±0.081，P＜0.01；OE33對照組為1.429±0.015，OE33 5-azaC組為0.627±0.086，P＜0.000 1，圖6）。

圖 5 5-azaC處理后細胞的Notch1的相對表達量Fig. 5 The relative expression of Notch1 after treatment with 5-azaC

圖 6 在TE-1與OE33細胞中，5-azaC處理后細胞中Notch1蛋白表達無變化，NICD蛋白顯著下調(diào)Fig. 6 Notch1 protein expression was kept unchanged and NICD was downregulated significantly when treated with 5-azaC in both TE-1 and OE33 cell lines

3 討 論

早期食管癌缺乏特異性癥狀，多數(shù)患者確診時已喪失手術切除機會。并且由于食管的解剖位置特殊，晚期食管癌容易導致患者營養(yǎng)不良，生存質(zhì)量極差，因此，放化療對提高患者生存質(zhì)量、延長生存期具有重要意義。對于不宜手術的患者，無論是食管鱗癌或腺癌，放化療聯(lián)合治療效果均優(yōu)于單純放療［9］。目前，食管癌化療沒有統(tǒng)一的治療標準，最常采用的是以順鉑、氟尿嘧啶及紫杉類藥物為基礎的化療方案，但由于藥物敏感性不同和耐藥性的產(chǎn)生，新的藥物還有待探索。5-azaC是美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，已廣泛用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如骨髓增生異常綜合征。在乳腺癌、肺癌和腸癌等實體瘤中，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑聯(lián)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑的表觀遺傳學聯(lián)合用藥也已處于臨床試驗階段，并且近期研究還顯示，這種聯(lián)合用藥方案有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的潛能［10］。目前尚未有指南把5-azaC列入食管癌的化療方案，5-azaC在食管癌中的作用也有待明確。

本研究選取人食管癌主要的病理類型鱗癌細胞系TE-1和腺癌細胞系OE33，初步研究5-azaC對食管癌細胞凋亡的影響及其潛在機制，以探究5-azaC成為食管癌治療藥物的可能性。CCK-8實驗研究結果顯示，5-azaC處理細胞24 h后，5-azaC對食管鱗癌和食管腺癌細胞系增殖均有明顯的抑制作用。流式細胞術結果顯示，5-azaC處理細胞后可以誘導TE-1及OE33細胞株發(fā)生細胞凋亡。Western blot結果也進一步證實5-azaC處理食管癌細胞后，抗凋亡蛋白BCL-XL蛋白表達量較之前降低。而細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡過程，細胞受到刺激后，促凋亡基因激活，抗凋亡基因受到抑制，最終激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase），使細胞死亡。凋亡逃逸則是腫瘤的主要特征之一，并且阻滯凋亡在多種模型系統(tǒng)中也被證實可以促使腫瘤發(fā)生［11］，因此促進腫瘤細胞凋亡已成為抗腫瘤治療的重要策略之一。

Notch信號通路是一條高度保守的通路，包含5個跨膜配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2）和4個膜結合受體（Notch1、Notch2、Notch3和Notch4）及其下游效應分子。其中，Notch1受體與鄰近細胞的配體結合后，經(jīng)過一系列水解激活，可將活化的NICD釋放到細胞質(zhì)中，NICD再轉(zhuǎn)入細胞核與其轉(zhuǎn)錄因子結合，進而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［12］。Notch通路不僅參與組織細胞的正常生長發(fā)育過程，包括干細胞的維持、增殖、分化及凋亡等，還與乳腺癌、胃癌及食管癌等多種腫瘤的發(fā)生有關［13-15］。其過度活化會抑制細胞分化，刺激細胞增殖，并促使其逃逸凋亡，獲得腫瘤細胞特性［12］。Notch1是潛在的食管癌驅(qū)動基因，其活化成分NICD在食管癌細胞中的表達明顯高于食管良性上皮；并且NICD的表達水平與食管癌的生存時間呈負相關［16］。因此，本研究嘗試性探究了在食管癌中5-azaC對Notch信號通路的影響，進而闡明5-azaC誘導食管癌細胞凋亡可能涉及的機制。

據(jù)文獻報道，5-azaC在誘導間充質(zhì)干細胞分化的過程中可影響Notch1的mRNA表達水平，使其表達增加［17-18］；用5-azaC處理惡性漿細胞瘤時則可使Notch的配體Jagged2表達量增加［19］；但也有研究顯示，在人惡性角質(zhì)形成細胞中Notch1及其配體Jagged1的表達不受5-azaC處理的影響［20］。本研究結果顯示，經(jīng)5-azaC處理后，TE-1及OE33細胞中Notch1 mRNA表達水平明顯升高，蛋白質(zhì)水平未受明顯影響。但Notch1受體的活性成分NICD的蛋白表達量顯著降低。因此，我們推測5-azaC抑制食管癌細胞增殖、促進細胞凋亡的作用機制可能與影響Notch1受體活化成分NICD的釋放，從而下調(diào)Notch1下游信號通路有關。

綜上所述，5-azaC能夠促進TE-1及OE33細胞凋亡，其涉及的機制可能與通過下調(diào)NICD蛋白從而抑制NICD下游信號通路有關。因此，5-azaC有望成為食管癌治療的有效藥物，更多的作用機制也有待進一步研究。