siRNA抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中SIRT6的表達(dá)及其生物學(xué)作用研究

余 天，李 娟，張偉凱，張 帆

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科，湖北 武漢 430030；

2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院干細(xì)胞研究與應(yīng)用中心，湖北 武漢 430022；

3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430030

骨肉瘤是最常見的來源于骨的惡性腫瘤，并且常好發(fā)于兒童及青年人的干骺端。盡管新輔助化療在骨肉瘤治療中得到了廣泛應(yīng)用，但預(yù)后仍不理想，尤其是對于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者。Sirtuins（SIRT1～SIRT7）蛋白家族是一類NAD+依賴的組蛋白去乙?；负拖佘斩姿幔╝denosine diphosphate，ADP）-核糖基轉(zhuǎn)移酶，參與機(jī)體的壽命調(diào)節(jié)、應(yīng)激及炎性反應(yīng)等病理生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6蛋白在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用［1-2］。Sebastián等［3］認(rèn)為體內(nèi)SIRT6缺乏可以促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲；Kugel等［4］認(rèn)為SIRT6可以抑制胰腺癌的生長；Bhardwaj等［5］發(fā)現(xiàn)SIRT6可以使PKM2去乙酰化從而減少核定位信號抑制癌基因的功能。另一些研究卻認(rèn)為SIRT6具有促進(jìn)腫瘤生成的作用，Ming等［6］發(fā)現(xiàn)人類鱗狀細(xì)胞癌中SIRT6表達(dá)明顯增高，Ran等［7］認(rèn)為SIRT6可以通過染色質(zhì)重排從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。但該蛋白在骨肉瘤中的作用仍不明確。本研究運用RNA干擾（RNA interference，RNAi）的方法抑制SIRT6在人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中的表達(dá)，觀察對骨肉瘤U2OS細(xì)胞系的生長、凋亡和侵襲性的影響，探討SIRT6在骨肉瘤中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系由本實驗室常規(guī)保存。該細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），并添加10%胎牛血清（美國Hyclone公司）和抗生素（美國Sigma-Aldrich公司）。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

SIRT6 siRNA序列為：5’-CGAGGAUG UCGGUGAAUUA-3’，由廣州市銳博生物科技有限公司合成，陰性對照購自廣州市銳博生物科技有限公司。質(zhì)粒通過LipofectamineTM2000系統(tǒng)（美國Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染SIRT6 siRNA組為實驗組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA為對照組。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

分別在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后將6孔板在冰面上用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液150 μL，超聲波破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移印跡到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉，加入抗體溫育2 h，洗滌，添加二抗（美國KPL公司）按1∶3 000稀釋，并采用ECL法（美國Thermo公司）檢測。結(jié)果經(jīng)灰度掃描分析，以SIRT6/β-actin相對蛋白表達(dá)水平表示。

1.3 采用Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入80%乙醇于4 ℃用PBS漂洗3次，加入RNase溶液靜置1 h，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液室溫避光染色30 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，方法按試劑盒說明書進(jìn)行，采用Cellquest軟件分析。以上實驗重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細(xì)胞增殖

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，每孔達(dá)到1×103個，加入胎牛血清，24 h后加入細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（上海炎彬化工科技有限公司）20 μL，培養(yǎng)箱溫育4 h后以490 nm波長測定吸光度（D）值，以24、48和72 h為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

利用Transwell小室（美國Coring公司）檢測骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，其中鋪有基質(zhì)膠的上室用于檢測細(xì)胞侵襲能力，無基質(zhì)膠的用于檢測細(xì)胞遷移。上室加入骨肉瘤細(xì)胞及無血清DMEM溶液，下室加入600 μL含20%胎牛血清溶液誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲和遷移。培養(yǎng)48 h后進(jìn)行Giemsa染色，鏡下隨機(jī)選擇5個200倍視野，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)，每組設(shè)3個復(fù)孔，計算其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)由SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以x±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SIRT6-siRNA抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中SIRT6基因的表達(dá)

分別在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24、48和72 h，行Western blot檢測U2OS細(xì)胞系中SIRT6的表達(dá)。結(jié)果顯示，24 h后實驗組SIRT6蛋白的表達(dá)被顯著抑制，與對照組相比下降約84%，72 h后仍較對照組減少約49%（圖1）。提示SIRT6-siRNA抑制骨肉瘤細(xì)胞SIRT6蛋白的表達(dá)效果顯著。

圖 1 Western blot檢測U2OS細(xì)胞SIRT6蛋白的相對表達(dá)Fig. 1 SIRT6 protein relative expression in U2OS cells detected by Western blot

2.2 下調(diào)SIRT6的表達(dá)對骨肉瘤U2OS細(xì)胞系增殖的影響

通過CCK-8法檢測結(jié)果繪制的生長曲線顯示，實驗組較對照組曲線略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

2.3 使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染2 4 h后使用A n n e x i n Ⅴ-F I T C雙染流式細(xì)胞術(shù)行凋亡檢測，實驗組平均值為（1 3.8 4±1.1 8）%，較對照組［（5.6 7±0.7 2）%］凋亡增加了約3倍（圖3）。說明抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞系SIRT6的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡增加，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 2 CCK-8法檢測U2OS細(xì)胞系的生長曲線Fig. 2 Growth curve of U2OS cells detected by CCK-8 method

圖 3 流式細(xì)胞儀檢測骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況Fig. 3 Cell apoptosis was detected by flow cytometry

2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力

用帶有基質(zhì)膠的Tanswell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力，轉(zhuǎn)染SIRT6-siRNA 24 h后，骨肉瘤U2OS細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（41.67±5.02）個，與對照組［（108.84±7.21）個］比較侵襲能力明顯減弱（P＜0.05），這說明抑制SIRT6可降低骨瘤U2OS細(xì)胞侵襲能力。同時利用不帶基質(zhì)膠的Transwell小室行細(xì)胞遷移檢測，發(fā)現(xiàn)實驗組遷移細(xì)胞個數(shù)為（57.83±4.15）個，與對照組［（140.21±5.33）個］相比顯著減少（P ＜0.05，圖4），提示抑制SIRT6表達(dá)可降低細(xì)胞遷移能力。

圖 4 Transwell實驗發(fā)現(xiàn)實驗組細(xì)胞侵襲及遷移能力下降Fig. 4 Decreased invasion and migration abilities in the experimental group detected by Transwell assay

2.5 下調(diào)SIRT6基因表達(dá)可以增強(qiáng)骨肉瘤U2OS細(xì)胞化療敏感性

通過抑制骨肉瘤SIRT6基因的表達(dá)觀察在紫杉醇處理后的溶液中腫瘤細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示，經(jīng)紫杉醇處理后，實驗組和對照組72 h的D值較未處理的實驗組和對照組都下降明顯，分別為（0.65±0.12）和（1.12±0.18），且經(jīng)紫杉醇處理的實驗組下降幅度更顯著（P＜0.05，圖5），說明下調(diào)骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中SIRT6的表達(dá)可以增強(qiáng)該細(xì)胞對化療藥物紫杉醇的敏感性。

圖 5 應(yīng)用CCK-8法檢測未經(jīng)及經(jīng)紫杉醇處理的骨肉瘤細(xì)胞生長情況Fig. 5 CCK-8 method was used to detect the U2OS osteosarcoma cells with or without exposure to taxol

3 討 論

SIRT6基因位于染色體19p13.3區(qū)域，其N端區(qū)域與組蛋白去乙酰化酶功能及染色質(zhì)結(jié)合有關(guān)，使其具有去乙酰化酶和ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。SIRT6在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在肌肉、大腦、心臟和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)較豐富，SIRT6參與包括心力衰竭及心肌肥大等多種病理過程的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)于SIRT6在腫瘤中的作用，目前得出了許多互相矛盾的研究結(jié)論。有結(jié)論認(rèn)為SIRT6是腫瘤抑制因子，Sebastián等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在人類一些腫瘤中SIRT6基因缺失，從而引起糖代謝增加及腫瘤生長；SIRT6過表達(dá)后可促進(jìn)乳腺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［8］。此外，SIRT6的過表達(dá)將增加人肺癌A549細(xì)胞對放射治療的敏感性，同時抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。另一些研究也顯示，SIRT6基因可能在不同的細(xì)胞中扮演不同的角色，在前列腺癌中SIRT6表達(dá)增高，下調(diào)SIRT6基因的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，Bcl基因表達(dá)下降促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且增加腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性［10］。同時在乳腺癌組織和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中SIRT6表達(dá)均升高，過表達(dá)SIRT6可使乳腺癌細(xì)胞對多柔比星和紫杉醇出現(xiàn)抵抗［11］。

但SIRT6在骨肉瘤中的作用還不清楚，有研究顯示，骨肉瘤中SIRT6表達(dá)增加，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲［12］。本研究也證實，通過下調(diào)骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中SIRT6的表達(dá)，可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且也證實下調(diào)SIRT6表達(dá)可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞在紫杉醇處理后的凋亡，從而增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。McCord等［13］發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SIRT6后很多細(xì)胞包括人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38細(xì)胞對于放射引起的DNA損傷更加敏感，證實SIRT6具有穩(wěn)定基因組的作用。但也有研究表明，SIRT6對不同的細(xì)胞作用不同。Wu等［14］報道，膀胱癌細(xì)胞肌肉侵犯T2期的腫瘤細(xì)胞，SIRT6表達(dá)下調(diào)并不會令腫瘤細(xì)胞對化療藥物致DNA損傷的敏感性增加。本研究證實在骨肉瘤細(xì)胞中，下調(diào)SIRT6基因的表達(dá)會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，促進(jìn)骨肉瘤U2OS細(xì)胞系的凋亡，減緩骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。在將來的研究中還需要更深入地探索SIRT6對骨肉瘤生物學(xué)效應(yīng)的具體分子機(jī)制，揭示該分子的確切作用。