環(huán)糊精增敏熒光法測定十字花科植物總芥子堿含量

鄭 丹， 王文靜， 張清峰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045)

芥子堿是一種季銨鹽生物堿(圖1)，廣泛存在于十字花科植物種子中，如白芥子、黃芥子、萊菔子、油菜籽等，并主要以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，芥子堿具有多種生理活性，可通過擴(kuò)張支氣管平滑肌，起到平喘的作用[2]；能夠抑制腫瘤血管的生成，起到抗腫瘤作用[3]；具有抗雄激素活性，起到抑制前列腺增生的作用[4]；芥子堿還具有降壓、降血脂、抗輻射、輔助神經(jīng)元再生等作用[5-8]。

《中國藥典》以芥子堿含量評價(jià)芥子、萊菔子等中藥材的質(zhì)量，要求芥子中芥子堿含量不低于0.5%，萊菔子中不低于0.4%[9]。目前，芥子堿的測定方法主要是通過高效液相色譜法(HPLC)[10-11]和毛細(xì)管電泳法[12]對芥子堿單體分離后再定量。這需要較長的分析時(shí)間及較為昂貴的設(shè)備和專業(yè)的人員操作，并且十字花科植物種子中還含有3-羥基-4-甲氧基桂皮酰膽堿、4-羥基苯甲酰膽堿、3，4-甲氧基苯甲酰膽堿、芥子酸等芥子堿衍生物，這些成分具有相似的生物活性[13]。因此，快速測定芥子中總芥子堿類含量對評價(jià)其藥材質(zhì)量也有一定的意義。測定總芥子堿的方法目前有分光光度法[14]和雷氏鹽沉淀法等[15]。本試驗(yàn)研究了芥子堿的熒光特性，并利用環(huán)糊精空腔包結(jié)作用的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，建立芥子堿含量的熒光測定方法，并用于4種十字花科植物種子中的總芥子堿含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與原料 芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；α-環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精購自江蘇豐園生物技術(shù)有限公司；萊菔子、黃芥子、白芥子購買于中藥店；油菜籽粕購買于菜市場；其他所用試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 970CRT型熒光分光光度計(jì)，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-5200PC型紫外可見分光光度計(jì)，購自上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芥子堿最佳熒光體系的建立 精確稱取芥子堿標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解得到濃度為1.35 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于4 ℃冰箱備用。(1)pH值的影響試驗(yàn)：準(zhǔn)確移取200 μL芥子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10 mL 容量瓶中，用不同pH值的磷酸緩沖液(0.2 mol/L)定容至10 mL，充分搖勻放置30 min后，在激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長470 nm條件下測量熒光強(qiáng)度。(2)CD的影響試驗(yàn)：用pH值為6的磷酸緩沖液(0.2 mol/L)配制濃度為10 mmol/L的α-CD、β-CD、γ-CD溶液。準(zhǔn)確移取200 μL芥子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入不同體積的CD溶液后，用pH值為6的磷酸緩沖液定容，充分搖勻后放置30 min，在激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長470 nm條件下測量熒光強(qiáng)度。

1.2.2 芥子堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別移取0、10、20、30、40、50 μL的芥子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入7 mL 15 mmol/Lβ-CD溶液(0.2 mol/L磷酸緩沖液配制，pH值為6)和1 mL 60%乙醇，用pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液定容至 10 mL。充分搖勻后在室溫下放置30 min，在激發(fā)波長 350 nm、發(fā)射波長470 nm條件下測量熒光強(qiáng)度。

1.2.3 十字花科植物中芥子堿的提取與測量 萊菔子、黃芥子、白芥子、油菜籽粕粉碎后過40目篩。準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品，加入25 mL 60%乙醇。采用浸提和超聲2種提取方式，浸提時(shí)間為120 min，超聲提取時(shí)間為30 min，提取均在常溫下進(jìn)行。提取完成后過濾，取0.2 mL濾液于10 mL容量瓶中，加入0.8 mL 60%乙醇，再加入7 mL 15 mmol/Lβ-CD溶液，用pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液定容至10 mL。充分搖勻后在室溫下放置30 min，在激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長470 nm 條件下測量熒光強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算芥子堿濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥子堿的熒光性質(zhì)

芥子堿在紫外光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，由圖2可知，芥子堿的最大激發(fā)波長為350 nm，最大發(fā)射波長為470 nm。

2.2 環(huán)糊精對芥子堿熒光強(qiáng)度的影響

環(huán)糊精是一類由D-吡喃型葡萄糖通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖，其分子形狀為上寬下窄中空的環(huán)筒狀，可與客體分子通過范德華力、疏水作用、空間匹配效應(yīng)及氫鍵等相互作用力形成主客體包合物。CD疏水性的空腔微環(huán)境可以影響客體分子的理化性質(zhì)，如改變其紫外-可見吸收、熒光等光譜性質(zhì)，從而在分析化學(xué)上有廣泛的應(yīng)用，可以提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性[16]。由圖3可知，芥子堿的熒光強(qiáng)度隨著α-CD和β-CD濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，而γ-CD的影響不明顯。并且β-CD會使芥子堿的最大發(fā)射波長向短波方向移動，從原來的470 nm藍(lán)移至460 nm。這些現(xiàn)象說明α-CD和β-CD可與芥子堿形成包結(jié)物，從而影響其熒光性質(zhì)。熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)可能是因?yàn)榻孀訅A分子進(jìn)入CD的疏水性空腔，增加了芥子堿的剛性結(jié)構(gòu)，減少了熒光猝滅，從而導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[16]。而γ-CD因?yàn)榭涨怀叽巛^大，與芥子堿空間匹配程度較差，不形成包結(jié)物。

根據(jù)芥子堿在470 nm處熒光強(qiáng)度隨α-CD和β-CD濃度的變化而變化，二者包結(jié)反應(yīng)的平衡常數(shù)K可以由Benesi-Hildebrand方程(公式1)求得[17]：

(1)

式中：F0為無CD時(shí)的熒光強(qiáng)度；F為添加不同濃度CD后的熒光強(qiáng)度；[CD]為CD濃度，mol/L；K為二者包結(jié)反應(yīng)的平衡常數(shù)，L/mol；[G]為芥子堿濃度，mol/L；Q為包結(jié)物熒光量子產(chǎn)率；k為儀器參數(shù)。由1/(F-F0)對1/[CD]作圖，通過斜率和截距可計(jì)算得到平衡常數(shù)K。如圖3-D所示，回歸曲線呈良好的線性關(guān)系，說明α-CD、β-CD與芥子堿的包合比為1 ∶1。計(jì)算結(jié)果列于表1，β-CD與芥子堿的包結(jié)平衡常數(shù)大于α-CD，說明β-CD與芥子堿包合物更穩(wěn)定。因?yàn)棣?CD更廉價(jià)易得，且與芥子堿包結(jié)更穩(wěn)定，所以后續(xù)試驗(yàn)選用β-CD為熒光增敏劑。

2.3 最佳熒光體系的建立

如圖4-A所示，芥子堿熒光強(qiáng)度在pH值為3～6的酸性條件下基本穩(wěn)定；隨著pH值的繼續(xù)升高，其熒光強(qiáng)度迅速下降。所以，選擇pH值為6的磷酸緩沖液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 環(huán)糊精與芥子堿包結(jié)反應(yīng)的平衡常數(shù)

芥子堿與CD的包結(jié)可能需要一定的時(shí)間才能穩(wěn)定，如圖4-B所示，芥子堿熒光強(qiáng)度隨放置時(shí)間的延長迅速下降，25 min后趨于穩(wěn)定。因此，后續(xù)試驗(yàn)中溶液配制混合均勻后，放置30 min再開始測量熒光強(qiáng)度。

在提取十字花科植物中芥子堿時(shí)，多用乙醇水溶液為提取溶劑[11，18-19]。因此，在測定實(shí)際樣品時(shí)，要考慮乙醇對芥子堿熒光的影響。如圖4-C所示，在10 mL容量瓶中加入不同體積的無水乙醇，因?yàn)橐掖紩绊懭軇O性，對芥子堿熒光強(qiáng)度影響很大。因此，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定樣品時(shí)要保證乙醇體積一致。

2.4 熒光法測定芥子堿方法考察

根據(jù)“1.2.3”節(jié)的方法步驟，測定一系列已知濃度的芥子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5所示，芥子堿的熒光強(qiáng)度與其濃度呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)體系中存在β-CD時(shí)，同一濃度的芥子堿熒光強(qiáng)度更高，說明β-CD有增敏效果。在空白體系中芥子堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.10x+22.53，r=0.998；添加β-CD后，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.94x+45.00，r=0.996；式中：y為熒光強(qiáng)度，x為芥子堿濃度，μg/mL。根據(jù)斜率比值，β-CD的增敏倍數(shù)為1.16倍。連續(xù)測定濃度為20 μg/mL的芥子堿標(biāo)準(zhǔn)品6次，計(jì)算熒光強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.67%，表明方法穩(wěn)定性很好。

2.5 十字花科植物樣品中芥子堿含量測定結(jié)果

采用常溫浸提和超聲輔助提取蘿卜籽、黃芥子、白芥子和油菜籽粕中的芥子堿，并利用建立的熒光定量方法進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。超聲輔助提取能有效提高芥子堿的提取效果，可能是因?yàn)槌暡ù┩噶?qiáng)，細(xì)胞更易破碎，因此提取效率更高。4種十字花科植物種子中，白芥子中芥子堿含量最高，為14.25 mg/g，其次為油菜籽粕，黃芥子含量最低，原因是十字花科植物種子中還含有3-羥基-4-甲氧基桂皮酰膽堿、4-羥基苯甲酰膽堿、3，4-甲氧基苯甲酰膽堿、芥子酸等芥子堿衍生物，這些化合物結(jié)構(gòu)相似，都會有熒光。因此，本法測定得到的是十字花科植物種子中總芥子堿含量。

表2 十字花科植物樣品中芥子堿含量測定結(jié)果

芥子堿的紫外吸收光譜在332 nm有最大吸收峰，因此也可以用分光光度法測定。本研究比較了分光光度法和熒光法的測定結(jié)果。在332 nm下，芥子堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 86x+0.006 82，r=0.997， 式中：y為吸光度；x為芥子堿濃度，μg/mL。對同一樣品的測定結(jié)果如表2所示，分光光度法測定的芥子堿含量普遍高于熒光法測定結(jié)果，這是因?yàn)榉止夤舛确]有選擇性，提取液中還含有其他在332 nm下有光吸收的物質(zhì)。而熒光法具有一定的選擇性，因此對于復(fù)雜樣品，測定結(jié)果比分光光度法更準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

芥子堿的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350、470 nm。α-CD和β-CD可以通過包結(jié)作用，增強(qiáng)芥子堿熒光強(qiáng)度。建立了芥子堿熒光定量方法，并用于萊菔子、黃芥子、白芥子和油菜籽等4種十字花科植物種子中的芥子堿含量的測定，結(jié)果表明白芥子中芥子堿含量最高，黃芥子最低。