船舶壓載水取樣分析方法分析

成海濤 賈在明

經(jīng)過IMO及航運(yùn)界的不斷努力，《國(guó)際船舶壓載水及沉積物控制和管理公約》（以下簡(jiǎn)稱《壓載水公約》）終于達(dá)到生效條件，并于2017年9月8日正式生效。但在公約實(shí)施過程中仍有各種矛盾和困難存在，實(shí)際操作中還有很多技術(shù)問題有待解決。例如，壓載水取樣分析方法與BWMS的型式認(rèn)可取樣分析方法不一致，PSC檢查過程中的取樣分析方法沒有統(tǒng)一等[1]。

一、壓載水取樣分析現(xiàn)狀介紹

《壓載水公約》雖已生效，但仍處于經(jīng)驗(yàn)積累期（EBP）。經(jīng)驗(yàn)積累期實(shí)施過程分為三個(gè)階段：數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分析和公約審議及修訂。國(guó)際海事組織海上環(huán)境保護(hù)委員會(huì)于2018年4月19日在倫敦召開第72界會(huì)議（MEPC72），會(huì)議對(duì)公約的EBP的數(shù)據(jù)收集和分析計(jì)劃（DGAP）時(shí)間表做了調(diào)整，要求于2019年匯總數(shù)據(jù)向MEPC74會(huì)議首次提交，于2022年向MEPC79會(huì)議提交關(guān)于公約修正的提案[2]。

經(jīng)驗(yàn)積累期需要收集眾多的數(shù)據(jù)，其中包括BWMS試用期間使用的取樣分析方法及結(jié)果。因此，PSC檢查過程中會(huì)出現(xiàn)兩種取樣分析的形式：

一種是為了收集數(shù)據(jù)而進(jìn)行大量詳細(xì)分析的取樣，可稱為“自愿性取樣”，此種非強(qiáng)制的取樣分析結(jié)論不能作為判定船舶壓載水處理是否滿足D-2標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。

另一種是依據(jù)《壓載水公約》第9條，港口國(guó)檢查中允許PSCO依據(jù)公約導(dǎo)則在必要的情況下進(jìn)行的取樣分析，可稱為“強(qiáng)制性取樣”，此種取樣分析結(jié)論如證明船舶不符合公約要求，可以作為PSCO處罰船舶的依據(jù)[3]。

二、壓載水取樣分析方法

（一）檢測(cè)壓載水D-1標(biāo)準(zhǔn)的方法

1.壓載水置換標(biāo)準(zhǔn)D-1

《壓載水公約》D-1標(biāo)準(zhǔn)要求實(shí)施壓載水置換的船舶容量置換率應(yīng)至少達(dá)到95%；泵流法置換的船舶，每個(gè)壓載艙應(yīng)泵入3倍艙容的水量。壓載水置換水域應(yīng)距離最近陸地至少200海里且水深至少200米；如船舶不能滿足上述要求時(shí)應(yīng)距離最近的陸地至少50海里且水深至少200米；此外，港口國(guó)可指定船舶進(jìn)行壓載水置換的水域。在規(guī)定的強(qiáng)制壓載水處理系統(tǒng)安裝日期前，現(xiàn)有船必須進(jìn)行壓載水置換并滿足D-1標(biāo)準(zhǔn)[3]。

2.壓載水D-1置換標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法

D-1置換標(biāo)準(zhǔn)不涉及壓載水內(nèi)生物個(gè)體的定量規(guī)定，主要是驗(yàn)證壓載水是否在深海開闊水域進(jìn)行了有效置換。因此，檢測(cè)方法主要是依據(jù)沿岸水域與深海開闊水域的不同特點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，一般從鹽度、濁度及含有機(jī)物等不同方面進(jìn)行檢測(cè)分析，主要的方法有：

（1）鹽度分析法

由于淡水與河流匯入海中，導(dǎo)致沿岸水域鹽度一般較深海水域低。深海水域的鹽度一般都高于30 PSU，如果檢測(cè)壓載水的鹽度遠(yuǎn)低于30 PSU則說明船舶可能沒有有效置換壓載水。實(shí)踐中一般使用電導(dǎo)計(jì)或鹽度計(jì)測(cè)量壓載水的鹽度。

應(yīng)注意有些港口的鹽度與開闊深海水域相似，在這些港口壓載的船舶，不應(yīng)將鹽度分析作為壓載水是否置換的唯一證據(jù)，應(yīng)結(jié)合或使用其他的檢測(cè)方法。盡管如此，鹽度分析法仍不失為檢驗(yàn)壓載水置換的一種較有效且簡(jiǎn)便的方法[4]。

（2）有色可溶性有機(jī)物含量分析法

沿岸水域的另一特點(diǎn)明顯區(qū)別于開闊深海水域，即有色可溶性有機(jī)物（CDOM，Colored Dissolved Organic Matter）的含量，CDOM是一種在光學(xué)上可以測(cè)量的水中溶解有機(jī)物。CDOM含量高的壓載水在短波波段有強(qiáng)烈的吸收光譜，如藍(lán)色到紫外；CDOM含量低或不含CDOM的壓載水在長(zhǎng)波波段有吸收，如紅色。因此，CDOM值高的壓載水顏色為綠色到黃綠色漸進(jìn)到褐色，而CDOM值低的壓載水顯示出藍(lán)色[5]。

沿岸水域受人類活動(dòng)影響比較大，如工業(yè)廢水、城市污水、農(nóng)業(yè)活動(dòng)排放廢水等，會(huì)使沿岸水域的CDOM值高；隨著離岸距離及水深的增加，CDOM值逐漸減小。通過使用三維熒光光譜（EEMS，Excitation/Emission Matrix Spectrometry）可以準(zhǔn)確測(cè)出CDOM的閾值[5]。CDOM的閾值可以作為判斷船舶壓載水是否置換的有力證據(jù)，實(shí)踐中一般使用便攜式養(yǎng)分傳感器進(jìn)行船舶壓載水CDOM閾值的檢測(cè)。

（二）檢測(cè)壓載水D-2處理標(biāo)準(zhǔn)的方法

1.壓載水D-2處理標(biāo)準(zhǔn)

在規(guī)定日期后，船舶必須安裝BWMS處理壓載水，并滿足D-2標(biāo)準(zhǔn)。公約規(guī)定的D-2標(biāo)準(zhǔn)要求如表1所示：

表1 船舶壓載水排放D-2標(biāo)準(zhǔn)[3]

2.壓載水D-2處理標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法

壓載水D-2處理標(biāo)準(zhǔn)要求比較嚴(yán)格，需要對(duì)壓載水中的不同尺寸水生物進(jìn)行定量檢測(cè)。其中細(xì)菌（有毒霍亂弧菌、大腸桿菌、腸道球菌）的檢測(cè)方法有相應(yīng)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO）可供參考，檢測(cè)壓載水時(shí)可直接引用；最小尺寸≥50微米的水生物一般為浮游動(dòng)物，具有移動(dòng)性（Mobility），可以通過立體顯微鏡直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)[6]，結(jié)合活體染色（下文詳述）可以收到更好的效果，在壓載水檢測(cè)過程中基本得到認(rèn)可[7]；最小尺寸≥10微米且<50微米的水生物一般不具移動(dòng)性，通常為單細(xì)胞浮游植物，很難直接觀測(cè)計(jì)數(shù)[8]。采取的其他檢測(cè)方法有多種，同時(shí)存在的爭(zhēng)議也比較多，下面簡(jiǎn)述對(duì)此類生物體的主要檢測(cè)方法：

（1）最可能數(shù)量連續(xù)稀釋培養(yǎng)法

最可能數(shù)量連續(xù)稀釋培養(yǎng)法（SDC，MPN method，The Serial Dilution Culture-Most Probable Number Method）是依據(jù)活的浮游植物具有繁殖能力來觀測(cè)壓載水中浮游植物細(xì)胞繁殖過程中葉綠素a的量變來計(jì)算細(xì)胞數(shù)量的方法。它是一種基于一系列稀釋樣本中浮游植物繁殖與不繁殖數(shù)據(jù)得分的二元計(jì)分?jǐn)?shù)學(xué)運(yùn)算。

SDC-MPN的做法是（如圖1所示）：

①取壓載水樣品，并進(jìn)行連續(xù)的稀釋。

②將稀釋液樣品在營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)及適宜的光照和溫度環(huán)境下培養(yǎng)。

③在培養(yǎng)的過程中，用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室熒光計(jì)監(jiān)測(cè)稀釋液中的葉綠素?zé)晒?，活?xì)胞會(huì)繁殖，葉綠素含量會(huì)增加，熒光信號(hào)也會(huì)增加。

圖1 SDC-M PN操作方法

④在培養(yǎng)前，如果稀釋液內(nèi)有可繁殖活細(xì)胞，哪怕只有一個(gè)活細(xì)胞，都會(huì)繁殖導(dǎo)致葉綠素增加，顯示為熒光的增加，此份稀釋液計(jì)為“+”。

⑤同理，如果在培養(yǎng)前稀釋液內(nèi)沒有活細(xì)胞繁殖，不會(huì)產(chǎn)生顯示熒光的增加，此份稀釋液計(jì)為“-”。

⑥利用稀釋倍數(shù)、稀釋液份數(shù)和每一次稀釋的正得分?jǐn)?shù)進(jìn)行MPN計(jì)算。

簡(jiǎn)單理解SDC-MPN檢測(cè)法，就是在壓載水一系列的稀釋過程中，找出活體可繁殖浮游植物的消失點(diǎn)，進(jìn)而反推出原始?jí)狠d水樣品中活細(xì)胞的數(shù)量。例如：如果可繁殖的活體細(xì)胞在10倍的稀釋液中檢測(cè)到，但在100倍的稀釋液中未檢測(cè)到，則原始樣品必須具有10至100個(gè)可繁殖活體細(xì)胞。通過稀釋倍數(shù)及MPN數(shù)學(xué)計(jì)算，可以確定更精確的結(jié)果[9]。

由于壓載水中最小尺寸為10～50微米的水生物一般為浮游植物，浮游植物為自養(yǎng)生物，能夠利用光能在其環(huán)境中從無機(jī)物中形成營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物質(zhì)，進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生葉綠素。因此，SDC-MPN方法適用于壓載水中10～50微米大小的可繁殖浮游植物的有效檢測(cè)[10]。

（2）活體染色法

活體染色法（The Vital Stain Method）是使用適合監(jiān)測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)或定位的熒光素染色劑應(yīng)用熒光顯微鏡來評(píng)估壓載水樣品中10～50微米大小的生物體的數(shù)量和狀態(tài)的方法。

常用的熒光素有二乙酸熒光素染色劑（FDA，F(xiàn)luorescein Diacetate）和5-氯甲基熒光素染色劑（CMFDA-5，Chloromethylfluorescein Diacetate），CMFDA是FDA的氯甲基衍生物，這類熒光素染色劑也稱為“活細(xì)胞示蹤劑”。FDA已經(jīng)被研究人員使用了幾十年，用于作為酶活性和活力的量度，包括細(xì)菌、硅藻、甲藻、綠藻、草本植物等，當(dāng)熒光素染色劑被動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞后，染色劑中的親脂性基團(tuán)就會(huì)被活細(xì)胞中的非特異性酯酶水解，生成不滲透的熒光產(chǎn)物在細(xì)胞膜內(nèi)保留下來[11]。但并非所有的生物都能被FDA染色，熒光信號(hào)常常不一致，CMFDA與FDA具有相同的熒光光譜，結(jié)合使用可以彌補(bǔ)這些缺陷。經(jīng)過CMFDA標(biāo)記的細(xì)胞產(chǎn)生可發(fā)出綠色熒光的5-氯甲基熒光素，熒光非常穩(wěn)定，且可分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的多代追蹤[12]。

活體染色法對(duì)于檢測(cè)壓載水中的活體水生物比較有效，可以區(qū)分出細(xì)胞是“活的（Live）”或“死的（Dead）”。

（3）流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（FCM， Flow Cytometry）是一種利用流式細(xì)胞儀對(duì)懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)、分析和分選的生物學(xué)技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是醫(yī)學(xué)、化學(xué)及電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展并綜合應(yīng)用的高科技產(chǎn)物。先進(jìn)的流式細(xì)胞儀可以高速分析成千上萬微小顆粒及細(xì)胞并可同時(shí)測(cè)得一個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)，將具有指定特性的顆粒有效區(qū)分并隔離[13]。

流式細(xì)胞儀的工作原理是對(duì)懸浮在液體中細(xì)胞或微粒進(jìn)行熒光標(biāo)記，使其流過光學(xué)或電子檢測(cè)器，通過熒光探測(cè)器捕獲檢測(cè)標(biāo)記的熒光信號(hào)，并將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成不同強(qiáng)度的電脈沖信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理形成相應(yīng)的點(diǎn)圖、直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)快速自動(dòng)的細(xì)胞分選和收集。

流式細(xì)胞儀可以對(duì)壓載水中的≥50微米與≥10微米且＜50微米可生存有機(jī)體（包括異樣生物）的數(shù)目進(jìn)行直接自動(dòng)的評(píng)估，是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。

三、壓載水取樣檢測(cè)方法存在的不足

分析壓載水檢測(cè)方法存在的不足之前，需要明確目前迫切需要統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)壓載水的方法應(yīng)具有哪些特點(diǎn)。從適用推廣的角度分析應(yīng)具有以下特點(diǎn)：一是要經(jīng)濟(jì)，檢測(cè)過程不能過于昂貴；二是操作應(yīng)相對(duì)簡(jiǎn)單，可以在全球范圍內(nèi)推廣使用；三是短時(shí)間內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，一般數(shù)小時(shí)，而不能是幾天，甚至幾周；四是現(xiàn)場(chǎng)可以檢測(cè)，不能必須帶到實(shí)驗(yàn)室才能得到結(jié)果，這也是最重要的一點(diǎn)。結(jié)合以上特點(diǎn)分析壓載水檢測(cè)方法存在的不足如下：

1.D-1壓載水置換標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法存在的不足

D-1置換標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)實(shí)施已久，技術(shù)方法也比較成熟，但仍存在不足，如：使用電導(dǎo)計(jì)和鹽度計(jì)測(cè)量鹽度法簡(jiǎn)便快捷，但是指標(biāo)檢測(cè)會(huì)受到溫度、壓力等外部因素的影響，以及港口水域鹽度較高時(shí)存在無法檢測(cè)的問題；使用CDOM含量分析法檢測(cè)比較可靠，但對(duì)檢測(cè)人員的素質(zhì)要求較高，而且附著在壓載艙內(nèi)壁在壓載水置換時(shí)無法排除的孢囊等有機(jī)體，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的正確性[14]。

2.D-2壓載水處理標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法存在的不足

（1）最可能數(shù)量連續(xù)稀釋培養(yǎng)法存在的不足

SDC-MPN檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于浮游植物物種識(shí)別和計(jì)數(shù)已經(jīng)超過50年，最近幾年才應(yīng)用于列舉壓載水內(nèi)總存活浮游植物的個(gè)數(shù)。如前所述，該方法對(duì)于檢測(cè)壓載水內(nèi)可繁殖浮游植物是比較有效的。SDC-MPN檢測(cè)方法存在以下不足之處：一是對(duì)于不能進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖的浮游植物以及異樣生物無法檢測(cè)；二是對(duì)于生長(zhǎng)繁殖緩慢的浮游植物也很難檢測(cè)；三是耗時(shí)比較長(zhǎng)，一般需要24小時(shí)到數(shù)月之久，而且會(huì)受到季節(jié)不同的影響[15]；四是需要培養(yǎng)專業(yè)的技術(shù)人員。

需要注意的是在申請(qǐng)BWMS的USCG型式認(rèn)可時(shí)，USCG不認(rèn)可SDC-MPN檢測(cè)法，而認(rèn)可使用FDA/CMFDA活體染色法。原因在于USCG要求的壓載水處理標(biāo)準(zhǔn)高于IMO處理標(biāo)準(zhǔn)。IMO壓載水處理D-2標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)的水生物為可繁殖新個(gè)體的水生物（Viable Organisms），而USCG的標(biāo)準(zhǔn)是活水生物（Living Organisms），SDC-MPN方法應(yīng)用促進(jìn)浮游植物增長(zhǎng)繁殖來檢測(cè)，無法對(duì)不繁殖“活的（Live）”的水生物計(jì)數(shù)，因此USCG不認(rèn)可此方法[4]。

（2）活體染色法存在的不足

CMFDA與FDA相結(jié)合的活體染色法（The Vital Stain Method）對(duì)于分析壓載水中的浮游生物（包括異養(yǎng)型生物）的確是較有效的方法。但此方法同樣存在一些問題：一是不同物種之間的染色強(qiáng)度不同，使得混合組合的評(píng)價(jià)容易出錯(cuò)；二是受假陽性干擾，有些明亮物種的死細(xì)胞熒光性比暗物種的活細(xì)胞高，在區(qū)分活細(xì)胞時(shí)會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤；三是同樣需要專業(yè)的技術(shù)人員，尤其在排除假陽性干擾時(shí)，對(duì)顯微鏡師確定熒光閾值的要求較高[16]。

（3）流式細(xì)胞術(shù)存在的不足

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一，使用流式細(xì)胞儀對(duì)船舶壓載水內(nèi)有機(jī)體直接計(jì)數(shù)，既準(zhǔn)確又可減少人工。不足之處是流體細(xì)胞計(jì)數(shù)成本比較高，且落后的國(guó)家和地區(qū)可能沒有此技術(shù)，同樣也需要專業(yè)的技術(shù)人員，全球推廣使用存在一定的困難[17]。

壓載水中最小尺寸≥10微米且＜50微米水生物的檢測(cè)方法除了這幾種以外，還有免疫熒光法及流式攝像機(jī)（根據(jù)葉綠素a和活體染色）檢測(cè)等，但每種方法都有其局限性，人員資質(zhì)水平、儀器準(zhǔn)確度等也會(huì)影響這些檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。不同的壓載水檢測(cè)方法適用于不同原理的BWMS，MEPC71次會(huì)議通過的BWM.2/Circ.61推薦檢測(cè)方法如表2所示。

四、結(jié)束語

壓載水取樣分析存在很大的復(fù)雜性和技術(shù)局限性，對(duì)于船上的壓載水管理人員來說似乎更是無能為力。在IMO沒有確定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法之前，確定了“對(duì)先行者不處罰”的原則，但前提是必須可提供足夠的文件證明滿足不處罰的前提條件。美國(guó)對(duì)船舶壓載水管理更為嚴(yán)格，要求安裝BWMS的船舶在第一年強(qiáng)制要求進(jìn)行兩次壓載水的取樣分析，根據(jù)分析結(jié)果確定下一年的取樣要求。因此，船上壓載水管理人員應(yīng)在全面了解壓載水管理、具備專業(yè)的管理知識(shí)的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格執(zhí)行壓載水管理計(jì)劃及BWMS廠家的操作說明書和技術(shù)說明書等，盡量使PSC檢查停留在初始檢查階段。

表2 推薦壓載水檢測(cè)方法