桃膠多糖的制備、質(zhì)量表征及利尿作用研究

任永申，張霏霏，白 杰，劉 鵬，雷 蕾，劉新橋

（中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074）

桃膠是桃樹薔薇科植物桃 Prunus persica（L.） Batsch或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的樹干受損傷如蟲咬、切傷等或致病后分泌出來的膠質(zhì)半透明物質(zhì)，經(jīng)過陽光暴曬或自然風(fēng)干等途徑獲得的固態(tài)物質(zhì)稱為原桃膠，呈半透明的棕黃色[1].桃膠屬樹膠類物質(zhì)，主要成分為多糖，其多糖含量高達(dá)90%以上，具有多糖類物質(zhì)的一般性質(zhì).《唐本草》記載:“桃膠，味甘苦，平，無毒，主下石淋，破血，中惡疰忤”.《本經(jīng)逢源》指出“桃樹上膠，最通津液，能治血淋、石淋”.現(xiàn)代研究證實(shí)多糖的藥理作用十分廣泛，具有提高免疫、抗腫瘤、清除自由基、抗衰老、抗感染、降血脂、降血糖等作用，但對其利尿通淋作用尚缺乏研究.同時(shí)，由于原桃膠在水中的溶解度較低，因而限制了其廣泛應(yīng)用[2].為了提高其溶解度以及保護(hù)生物、化學(xué)和物理性質(zhì)，本文采用水提醇沉法制備水溶性桃膠多糖，采用DNS法測定多糖并含量，并采用紅外光譜法測定桃膠多糖化學(xué)特征圖譜，并采用水負(fù)荷模型考察其利尿作用，以期為桃膠的藥效作用研究及開發(fā)利用提供新的科學(xué)依據(jù)[3].

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品

原桃膠（購自亳州藥材市場，由中南民族大學(xué)藥學(xué)院劉新橋副教授鑒定為桃 Prunus persica（L.）Batsch的膠狀分泌物）.

1.2 動(dòng)物

KM小鼠，雌性，體重20～22 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，動(dòng)物許可證號:SCXK（鄂）2015-0018.小鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由采食飲水，執(zhí)行12小時(shí)明暗循環(huán)，室溫23～25℃，相對濕度40%～70%.

1.3 試劑

D-木糖對照品（50mg/支，中國食品藥品檢定研究院），DNS試劑實(shí)驗(yàn)室自制，呋塞米片（規(guī)格為20mg/片，江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司），Na試劑（批號:20180702），K 試劑盒（批號:20180714），Cl試劑盒（批號:20180714），超微量 ATP 酶（Na＋-K＋-ATP酶）測試盒（批號:20180714），以上試劑盒全購自于南京建成生物工程研究所.

1.4 儀器

全波長酶標(biāo)儀（Multiskan Go，賽默飛世爾科技公司），傅立葉變換紅外 （FTIR）光譜（Thermo Fisher Scientific），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠），UV-8000型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）.

2 方法

2.1 桃膠多糖樣品制備

稱取原桃膠50 g，用打粉機(jī)打磨成粉，過80目藥典篩，用所篩桃膠粉按料液比1:100進(jìn)行蒸餾水回流提取.首先，將過篩后的桃膠粉與蒸餾水按1:100料液比于60℃烘箱中浸泡30 h（浸脹完全），之后加熱回流煮沸5 h.隨后用多層紗布連續(xù)抽濾兩次桃膠水解液，除去不可溶的雜質(zhì).將抽濾所得的桃膠水解液濃縮至原體積的1/5，采用Sevag試劑（氯仿:正丁醇＝4:1）多次萃取，除去蛋白；然后水浴加熱去除蛋白的桃膠水解液，用30%H2O2脫色至無氣泡產(chǎn)生后，再次濃縮至原體積的1/5；再用90%的乙醇沉淀過夜，8000 rpm/min離心20 min，得沉淀，即為桃膠多糖（Peach Gum Polysaccharides，PGP）；將桃膠多糖置于60℃烘箱中烘干，粉碎，貯存?zhèn)溆肹4].

2.2 桃膠多糖含量測定與化學(xué)指紋圖譜建立

2.2.1 桃膠多糖的含量測定

（1）D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥恒重D-木糖適量，加水溶解，配制成 400.0 mg/L，精密移取木糖對照液 0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置于具塞試管中，分別加水至2 mL，加入1.5 mLDNS試劑，搖勻，于沸水中浴中加熱5 min，取出后迅速冷卻，于500 nm下測定其吸光度.以對照品濃度與吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

（2）多糖含量的測定

稱取適量干燥的桃膠多糖粉末，加水配制成400 mg/L，精密移取0.5 mL置具塞試管中，加水至2 mL，加入1.5 mLDNS試劑，搖勻，于沸水中加熱5 min后迅速取出，并于5000 nm下測定其吸光度.代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中即得多糖含量.

2.2.2 桃膠多糖的紅外光譜指紋圖譜建立方法

取干燥的桃膠多糖粉末2 mg，與KBr粉末混合壓片制樣，F(xiàn)T-IR對樣品在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到圖1所示的紅外光譜圖.

2.3 桃膠多糖的利尿作用研究

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后開始實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)前取健康小鼠，預(yù)先置于代謝籠中使其適應(yīng)環(huán)境，灌胃給予生理鹽水（劑量為0.1 mL/10g），觀察自由飲水條件下動(dòng)物尿量是否穩(wěn)定.收集3 h內(nèi)尿量，挑選尿量達(dá)到灌入純凈水量40%以上的動(dòng)物，用于利尿?qū)嶒?yàn)研究.

實(shí)驗(yàn)前稱量小鼠體重，選取20～25 g健康昆明小鼠25只，隨機(jī)均分為正常組、呋塞米對照組（30 mg/kg），桃膠多糖高（6 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）劑量組，每組5只.動(dòng)物禁食不禁水15 h，每只給予腹腔注射生理鹽水1 mL，30 min后各組別按照組別所對應(yīng)的劑量灌胃給藥[5].給藥后輕輕壓迫小鼠下腹（膀胱所對應(yīng)的位置），排盡膀胱中余尿，然后將小鼠置玻璃漏斗中，上方蓋上培養(yǎng)皿厚蓋，漏斗尖嘴插入錐形瓶中，用以收集尿液.每間隔1 h即開始收取小鼠尿液，此過程共進(jìn)行4 h，連續(xù)進(jìn)行6 d.記錄每1小時(shí)所對應(yīng)小鼠的尿量，隨后3 500 rpm/min離心10 min，凍存于-80℃冰箱中，備用[6-7].收集最后一天給藥后4 h內(nèi)的總尿液，按各試劑盒方法測史各組小鼠尿液電解質(zhì)鈉、鉀、氯離子濃度，腎臟Na＋-K＋-ATP酶活力.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PGP多糖含量測定結(jié)果

由木糖對照品的吸光度和濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y ＝ 0.0019X ＋ 0.1386 （R2＝0.9991）（eq1）.通過計(jì)算，得桃膠多糖的含糖量為96.30%，提示制備得到的桃膠多糖純度較高.

3.2 PGP紅外指紋圖譜測定結(jié)果

紅外光譜顯示，在波數(shù)3 398.57 cm-1處的強(qiáng)吸收峰為-OH的伸縮振動(dòng)，2 933.73 cm-1處為-CH2的非對稱伸縮振動(dòng)，而在1 624.06 cm-1帶有許多小鋸齒狀的中強(qiáng)度吸收峰，為桃膠多糖中-CHO的特征吸收峰.1 419.61-1 200.00 cm-1之間有較大的鋸齒狀吸收峰，說明有苯環(huán)的三個(gè)特征骨架振動(dòng)，而在1 043.49cm-1處有較強(qiáng)吸收峰，表明有C-O-C的伸縮振動(dòng).

圖1 桃膠多糖的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of PGP

3.3 PGP的利尿作用

與正常對照組比較，桃膠多糖各不同給藥組和呋塞米組在小鼠給藥后 1 h內(nèi)尿量明顯增加 （P＜0.01）；桃膠多糖高、中劑量組在小鼠給藥2 h后尿量也明顯增多（P＜0.001，P＜0.05）；2 h過后，呋塞米組和桃膠多糖低、中劑量組相比于空白組無顯著增加，說明這幾組對小鼠尿量增加無穩(wěn)定持續(xù)的利尿作用；而桃膠多糖高劑量組（6 g/kg）小鼠給藥后4 h內(nèi)尿量明顯增加（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05），表明桃膠多糖具有明顯且持續(xù)的利尿作用.桃膠多糖各劑量組在小鼠給藥后0～1 h的尿量與呋塞米組比較有顯著性差異（P＜0.05），表明桃膠多糖利尿作用較呋塞米緩和.桃膠多糖高劑量組相比于呋塞米在2-3 h具有顯著性差異（P＜0.05），表明桃膠多糖高劑量組對小鼠的利尿作用持續(xù)時(shí)間較長.綜上，可以得到桃膠多糖各給藥組的利尿作用則較為均勻持久，且對機(jī)體的刺激性相比于呋塞米來說也較小.結(jié)果見表1.

表1 不同劑量PGP對小鼠利尿作用結(jié)果Table 1 The diuretic effect of different doses of PGP in mice

3.4 PGP對小鼠尿液電解質(zhì) Na＋、K＋、Cl－的影響

與空白對照組比較，PGP各不同劑量組和呋塞米皆可以顯著增加小鼠尿液中的Na＋含量（P＜0.01或P＜0.05），在K＋排量上，在 Cl－排量上，與空白組相比，各給藥組都無顯著性差異，但呋塞米相比于空白組而言其Cl－含量有所升高，由于小鼠之間個(gè)體差異的影響，未能較好體現(xiàn)出呋塞米排Cl－的作用.而PGP各不同劑量組對小鼠尿液中Cl－排量無較大影響.結(jié)果見表2.

3.5 桃膠多糖不同劑量組對小鼠腎臟Na＋-K＋-ATP酶活力的影響

與空白組相比，呋塞米給藥組腎臟組織中Na＋-K＋-ATP酶活力有顯著性差異（P＜0.05），其余各桃膠多糖不同劑量組無顯著性差異，結(jié)果如表3.

表3 PGP不同劑量組對小鼠腎臟Na＋-K＋-ATP酶活力的影響Table 3 Effects of different doses of PGP on Na＋-K＋-ATPase activity in mice kidney

4 討論

中藥利尿通淋藥常用于治療水濕壅盛型癃閉、淋濁、水腫、泄瀉等[8]，是探索開發(fā)利尿藥的重要依據(jù).本文制備得到純度較高的桃膠多糖，水溶性較好，色澤均勻，并對其含量和化學(xué)特征圖譜進(jìn)行測定，對質(zhì)量進(jìn)行表征，有利于后期產(chǎn)品的開發(fā).傳統(tǒng)文獻(xiàn)記載桃膠具有利尿通淋作用，但其主要成分桃膠多糖的利尿作用及其機(jī)制尚未報(bào)道，本研究選取尿量、尿液離子、Na＋-K＋-ATP等指標(biāo)對PGP利尿作用及機(jī)制開展探索研究[9].結(jié)果表明，PGP低、中、高劑量組對于生理鹽水負(fù)荷小鼠均有較明顯的利尿作用，且作用較為均勻持久，不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)電解質(zhì)紊亂且不受體內(nèi)酸堿平衡變化的影響.

呋塞米為髓袢利尿藥[10].呋塞米在1～2h利尿作用較明顯，屬于強(qiáng)效利尿藥，這一點(diǎn)也得到了證實(shí)（如表1），但該種藥物可導(dǎo)致低血鉀、低血鈉等副作用.從表2中可以看出，隨著PGP劑量的增加，小鼠尿液中的Na＋含量是下降的，而其對Cl－排出量無影響.呋塞米組的 Na＋、Cl-排出量及 Na＋/K＋值均顯著升高，說明3種離子的損失都較為嚴(yán)重，易出現(xiàn)低鈉低鉀血癥[11].隨著臨床廣泛應(yīng)用，其配伍禁忌與不良反應(yīng)的報(bào)道逐漸增多[12-13].對比臨床常用利尿藥呋塞米，PGP對動(dòng)物Na＋/K＋值基本上與空白對照組相等，說明了對小鼠尿液中Na＋、K＋排出無明顯干擾，可以避免機(jī)體電解質(zhì)紊亂，其對于生理鹽水負(fù)荷小鼠可通過促進(jìn)Na＋、K＋、Cl－的排出，以維持體內(nèi)水電解質(zhì)的平衡[14].

細(xì)胞內(nèi)外鈉和鉀離子的交換是通過 Na＋-K＋-ATP酶來進(jìn)行的，它有利于維持細(xì)胞內(nèi) Na＋、K＋濃度的相對恒定、保持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境適當(dāng)?shù)臐B透壓平衡.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PGP對腎臟組織Na＋-K＋-ATP酶活力沒有顯著影響，另一方面，PGP給藥組的Na＋/K＋值和空白組相差不大，無顯著性差異，綜合說明了PGP的利尿作用與改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓無明顯的相關(guān)性.另一方面，PGP可能是通過調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)、消化液的分泌、消化道對水的吸收等其他途徑實(shí)現(xiàn)的[15].

綜上，現(xiàn)今在臨床上經(jīng)常使用的利尿藥大多數(shù)以呋塞米，噻嗪類等為代表的一系列傳統(tǒng)化學(xué)藥物，這些藥物在發(fā)揮利尿作用的同時(shí)也經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)（如引起電解質(zhì)代謝紊亂、肝腎毒性等）[16].桃膠多糖與傳統(tǒng)化學(xué)藥物比較，不引起機(jī)體電解質(zhì)紊亂，不良反應(yīng)輕，作用持久溫和，具有較好的開發(fā)前景，可進(jìn)一步對其多糖成分進(jìn)行研究，為開發(fā)中藥利尿藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).