樺褐孔菌三萜的?；瘜ζ淇鼓[瘤活性的影響

鄧麗穎，楊燦宇，閆亞輝，李佳偉，岑如月，趙 輝

（1．河南省輝縣市人民醫(yī)院，輝縣 453600；2．河南大學(xué)藥學(xué)院，開封 475004）

樺褐孔菌[Inonotus obliquus（Fr．）Pilat]為擔(dān)子菌亞門、多孔菌目、刺革菌科的藥用真菌，在亞洲、歐洲及北美洲均有分布，它作為抗腫瘤藥物在民間使用已有很長歷史[1－2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗證明樺褐孔菌可抑制NCI－H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞、HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞及B16－F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的生長，并可逆轉(zhuǎn)Hep2/R肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性[3－4]。樺褐孔菌的化學(xué)成分主要為羊毛脂烷型三萜類化合物[5－7]，其中以 inotodiol和 trametenolic acid 2個化合物的含量最高，他們也是樺褐孔菌中眾多其他次生代謝產(chǎn)物的生物原料。本實(shí)驗擬從樺褐孔菌中分離制備inotodiol、trametenolic acid及抗腫瘤活性化合物inonotusane A，并以此為原料制備其酰化產(chǎn)物，進(jìn)而考察其結(jié)構(gòu)變化前后的抗腫瘤活性，為樺褐孔菌三萜的結(jié)構(gòu)修飾方向提供參考，inotodiol、trametenolic acid及inonotusane A的結(jié)構(gòu)見圖1。

1 儀器與材料

AVANCE400M核磁共振儀（1H HNMR:400MHz，13CNMR:100 MHz，德國 Bruker公司）；高分辨質(zhì)譜（安捷倫公司）；VERTEX70傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker公司）；XT6顯微熔點(diǎn)測定儀（北京市科技電光儀器廠）；制備型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津），制備型HPLC色譜柱為Shim－pack PREP－ODS（H）KITcolumn（250 mm ×20 mm,5μm）；十八烷基鍵合固定相（Rp－18）柱層析材料（Merck公司），Rp－18高效薄層預(yù)制板（Merck公司），柱色譜用硅膠200～300目（青島海洋化工廠）；色譜甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司），本實(shí)驗所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

本實(shí)驗所用藥材采自吉林省琿春地區(qū)，由本實(shí)驗室鑒定為 Inonotus obliquus（Fr．）Pil。紫杉醇注射液（5 mL,30 mg）購自海南中化聯(lián)合制藥工業(yè)股份有限公司，批號20130806。

2 實(shí)驗方法

2.1 原料化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 取干燥粉碎的樺褐孔菌子實(shí)體10 kg，采用95%乙醇回流提取5次，每次1 h，得到乙醇提取物430．5 g。將乙醇提取物均勻分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃?。?5 L×3）得到各萃取物。將乙酸乙酯萃取物（198．2 g）用硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯）粗分為Fr．1～10共10部分。將餾分Fr．2再用硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯μ從100∶0到0∶100比例梯度洗脫）分離得到inotodiol（1）；將餾分Fr．3也用硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯）分為 3 部分 Fr．3．1～3．3，進(jìn)而將Fr．3．1進(jìn)行ODS開放柱層析（甲醇－水）和制備型HPLC（甲醇∶水為77∶23）進(jìn)行分離，得到inonotusane A（3）；將餾分 Fr．4 采用 ODS 開放柱層析分為 Fr．4．1～4．5，再將 Fr．4．3 采用硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 13∶0．95∶0．05） 分離，得到 trametenolic acid（2）。

2.2 目標(biāo)化合物的制備 化合物1（a－c）的制備：稱取干燥的inotodiol（1）220 mg置于100 mL的圓底燒瓶中，加入約22 mL氯仿將化合物inotodiol溶解，另取506 mg的干燥琥珀酸酐，使用約8．8 mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF）溶解后，加入圓底燒瓶中，再加入吡啶10μL和4－二甲氨基吡啶（DMAP）適量，攪拌下加熱至回流約7 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)物反應(yīng)完全。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出氯仿后，加入蒸餾水30 mL，用稀 HCl調(diào) pH 2～3，再用乙酸乙酯（4×20 mL）萃取，合并乙酸乙酯萃取液，用70 mL飽和鹽水洗滌4次，再加入無水硫酸鈉干燥。次日，將有機(jī)相蒸干，硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 20∶0．95∶0．05）分離純化后，用制備型HPLC分離，分別得到化合物1a（甲醇∶水為 77∶23,tR164．8 min）、1b（甲醇∶水為 77∶23,tR65．5 min）和 1c（甲醇∶水為 84∶16,tR30．5 min）。

化合物2a的制備：稱取干燥的trametenolic acid（2）320 mg置于100 mL的圓底燒瓶中，加入約10 mL吡啶將化合物trametenolic acid溶解，另取560 mg的干燥琥珀酸酐，用約10 mL DMF溶解后，加入圓底燒瓶中，再加入DMAP適量，攪拌下加熱至83℃，反應(yīng)約17 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)物反應(yīng)完全。將反應(yīng)液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸1h后，加入蒸餾水20mL，用稀 HCl調(diào) pH 2～3，再用乙酸乙酯（4×20 mL）萃取，合并乙酸乙酯萃取液，用70 mL飽和鹽水洗滌4次，再加入無水硫酸鈉干燥。次日，將有機(jī)相蒸干，ODS開放柱層析（甲醇∶水為90∶10）分離純化后，用硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 9∶0．95∶0．05）分離，得到化合物2a。

化合物3a的制備：稱取干燥的inonotusane A（3）12 mg置于25 mL的圓底燒瓶中，加入約3 mL氯仿將化合物inonotusane A溶解，另取25 mg的干燥琥珀酸酐，用約1 mLDMF溶解后，加入圓底燒瓶中，再加入吡啶10μL和DMAP適量，攪拌下加熱至回流約10 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)物反應(yīng)完全。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出氯仿后，加入蒸餾水5 mL，用稀HCl調(diào)pH 2～3，再用乙酸乙酯（4×5 mL）萃取，合并乙酸乙酯萃取液，用20 mL飽和鹽水洗滌4次，再加入無水硫酸鈉干燥。次日，將有機(jī)相蒸干，制備型HPLC（甲醇∶水為95∶5）分離純化后，用硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 8∶0．95∶0．05）分離，得到化合物 3a。

圖1 目標(biāo)化合物1（a-c）、2a和3a的合成路線Fig.1 Systhesisrouteof the objective compounds1(a-c),2a and 3a

圖2 化合物3a的17-側(cè)鏈的NOESY相關(guān)情況Fig.2 Key NOESY correlations of 17-sidechain in 3a

2.3 體外抗腫瘤活性 采用噻唑藍(lán)（MTT）法測試化合物 1－3 及 1a、1b、1c、2a、3a 對 A549 人肺癌、Hela人宮頸癌、MCF－7人乳腺癌及4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株的抑制活性。實(shí)驗中，受試化合物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成10 mmol/L的母液，－20℃儲存，臨用前于37℃恒溫解凍后，采用不加血清的培養(yǎng)基將母液稀釋至不同濃度；對照品采用紫杉醇注射液，其中紫杉醇的濃度為7 mmol/L，將其按藥品說明書進(jìn)行儲存，臨用前采用不加血清的培養(yǎng)基將其稀釋至不同濃度。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板中，每孔加入100μL，將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h；待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基棄去，加入充分混勻的含有不同濃度藥物（待測化合物及陽性對照化合物）的培養(yǎng)基至96孔板中，每孔加入100μL，藥物濃度分別為 1、5、10、30、50 μmol/L，每種濃度設(shè)4個復(fù)孔，其中，調(diào)零組不接種細(xì)胞，空白組接種細(xì)胞但不加藥；將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；將培養(yǎng)基吸出，每孔加入MTT試劑100μL，將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸出上清液，每孔加DMSO 100μL，振蕩 5～10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀 490 nm處測量各孔的吸光度值，計算腫瘤細(xì)胞的抑制率及化合物的IC50值。

3 實(shí)驗結(jié)果

化合物 1：白色粉末（1．2 g），ESI－MSm/z：465．57[M+Na]+,481．43[M+K]+，其1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)分別見表1和表2。通過與文獻(xiàn)報道對照，將其鑒定為inotodiol[8]。

化合物 2：白色粉末（802 mg），ESI－MS m/z：455．62[M－H]－，其1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)分別見表 2 和表3。通過與文獻(xiàn)報道對照，將其鑒定為trametenolic acid[9]。

化合物 3：白色粉末 （23 mg,tR43．7 min），HRESIMS確定其分子式為C30H50O3（[M+Na]+,m/z 481．365 4;calcd 481．365 8），其1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)分別見表2和表3。通過與文獻(xiàn)報道對照，將其鑒定為inonotusane A[10]。

化合物 1a：白色粉末（20 mg），回收率 7．4%，HRESIMS確定其分子式為C34H54O5（[M+Na]+,m/z 565．386 8;calcd 565．386 9）。IR（KBr）νmax:3 450,2 924,1727,1454,1375,1166cm－1。1HNMR（400MHz，CD3OD）數(shù)據(jù)見表1，經(jīng)與原料化合物1對照，并參考文獻(xiàn)[11]，3－H 的化學(xué)位移由 δH3．24（dd,J=9．2,4．4 Hz）增大至 δH4．48（dd,J=9．2,7．2 Hz）；同時，化合物1a增加了4個質(zhì)子信號δH2．59（4H,m）。13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：174．2,135．9,135．7,133．2,123．6,82．6,74．9,52．1,50．7,46．0,44．2,39．0,38．2,36．5,32．3,32．1,30．7,30．1,28．5,28．5,27．6,26．1,25．1,24．7,22．1,19．7,19．3,18．0,17．1,16．2,13．1。

表 1 化合物 1 和 1（a-c）的 1H-NMR（400 MHz，δ in ppm,J in Hz）Tab.1 1H-NMR data of compounds1,1a,1b and 1c(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

化合物 1b：白色粉末（30 mg），回收率 11．1%，HRESIMS確定其分子式為C34H54O5（[M+Na]+,m/z 565．386 6;calcd 565．386 9）。IR（KBr）νmax:3 448,2 924,1 726,1 454,1377,1 169,1 058 cm－1。1H NMR（400 MHz，CD3OD）數(shù)據(jù)見表1，經(jīng)與原料化合物1 對照，并參考文獻(xiàn)[11]，22－H 的化學(xué)位移由 δH3．68（1H,m）增大至δH4．90（1H,m）；同時，化合物1b增加了4 個質(zhì)子信號 δH2．55（4H,m）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：174．0,136．2,135．6,134．4,121．9,79．7,78．6,52．0,50．7,46．1,41．2,40．0,38．3,37．0,32．3,32．0,30．9,28．7,28．5,28．0,27．7,27．7,26．0,24．7,22．1,19．7,19．5,18．0,16．2,16．2,13．8。

化合物 1c：白色粉末（103 mg），回收率 32．2%，HRESIMS確定其分子式為C38H58O8（[M+Na]+,m/z 665．402 8;calcd 665．403 0）。IR（KBr）νmax:3 385,2 946,2 836,1 731,1 371,1 171,1 024 cm－1。1H NMR（400 MHz，CD3OD）數(shù)據(jù)見表1，經(jīng)與原料化合物1對照，并參考文獻(xiàn)[11]，3－H 的化學(xué)位移由 δH3．24（dd,J=9．2,4．4 Hz）增大至 δH4．48（dd,J=8．8,7．6 Hz），同時，22－H 的化學(xué)位移由 δH3．68（1H,m） 增大至 δH4．91（1H,m）；此外，化合物 1c 增加了 8 個質(zhì)子信號δH2．57（8H,m）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：176．0,176．0,174．0,173．8,135．8,135．7,134．5,121．9,82．5,78．5,52．0,50．7,46．1,41．2,39．0,38．2,36．5,32．2,32．0,30．6,29．9,28．5,28．0,27．6,27．6,26．1,25．1,24．8,22．1,19．7,19．3,18．1,17．1,16．2,13．8。

化合物 2a：白色粉末（150 mg），回收率 38．4%，HRESIMS 確定其分子式為 C34H52O6（[M－H]－,m/z 555．368 8;calcd 555．368 6）。IR（KBr）νmax:2 950,1716,1657,1375,1266,1179cm－1。1HNMR（400MHz，CD3OD）數(shù)據(jù)見表3，經(jīng)與原料化合物2對照，并參考文獻(xiàn)[11]，3－H 的化學(xué)位移由 δH3．00（1H,m）增大至 δH4．39（1H,m）；同時，化合物 2a 增加了 4 個質(zhì)子信號 δH2．50（4H,m）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：180．5,176．0,174．1,135．7,135．7,133．0,124．9,82．6,52．0,50．7,49．3,48．5,45．5,39．0,38．2,36．5,33．8,31．5,30．6,30．1,29．9,28．5,28．2,27．5,27．0,26．0,25．1,24．8,22．0,19．7,19．2,17．8,17．1,16．5。

化合物 3a：白色粉末（4 mg），回收率 27．4%，mp 149．5～150．6 ℃，HRESIMS 確定其分子式為 C34H54O6（[M+Na]+,m/z 581．381 7;calcd 581．381 8）。IR（KBr）νmax:3 436,2 952,1 645,1 452,1 372,1 160,1 017,667 cm－1。1H NMR（400 MHz，CD3OD）數(shù)據(jù)見表 3，與原料化合物3對照顯示，3－H的化學(xué)位移由δH3．24（dd,J=11．6,4．4Hz）增大至 δH4．38（dd,J=8．8,7．2Hz）；同時，化合物3a增加了4個質(zhì)子信號δH2．49（4H,m）。13C NMR （100 MHz，CD3OD）δ：176．0,174．1,136．1,135．6,82．7,76．3,73．4,54．5,52．1,50．6,49．9,45．6,44．6,39．0,38．2,36．6,32．2,31．2,30．6,30．6,30．0,30．0,29．4,29．1,28．5,28．2,27．6,25．1,25．0,22．1,19．7,19．3,17．6,17．1。為證實(shí) inonotusane A（3）反應(yīng)生成3a后，其側(cè)鏈上的五元環(huán)構(gòu)型未發(fā)生變化，通過HSQC譜對目標(biāo)化合物3a的1H NMR和13C NMR進(jìn)行歸屬后（表2），進(jìn)一步分析其NOESY譜（圖 2）可見 H－17/H3－30相關(guān)峰，表明 H－17為 α－構(gòu)型；另外可見 H－21/H－20和H－21/H3－18相關(guān)峰，而未見H－20/H－17相關(guān)峰，證實(shí)了21β－H和22β－H；同時H－21/H－24相關(guān)峰證明H－24為β－構(gòu)型?；衔?1、2、3、1a、1b、1c、2a、3a的結(jié)構(gòu)見圖 1。

MTT實(shí)驗結(jié)果如表4所示，化合物1的3－位、22－位酰化后（1a,1b,1c）對A549和4T1腫瘤細(xì)胞的抑制活性均增強(qiáng)，此外，而其3－位?；螅?a）還大大增強(qiáng)了對MCF－7腫瘤細(xì)胞的抑制活性。化合物2?；髮钚詿o影響。化合物3的3－位?；髮549、MCF－7及4T1細(xì)胞的抑制活性均明顯增強(qiáng)，其中對A549表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗腫瘤活性（IC50=9．53 μmol/L）。

4 討論

所有化合物在結(jié)構(gòu)修飾前后對HeLa細(xì)胞的抑制活性均未發(fā)生變化，而對其他腫瘤細(xì)胞的抑制活性卻明顯增強(qiáng)（2a除外），推測HeLa細(xì)胞對于化合物結(jié)構(gòu)中引入此類酰基并不敏感。2和2a對所有腫瘤細(xì)胞均無抑制活性，說明化合物的酰化并不能增強(qiáng)活性，應(yīng)嘗試其他的結(jié)構(gòu)修飾方式。1a、1b、1c和3a均比其原料化合物具更強(qiáng)的抗腫瘤活性，故inotodiol（1）的 3 位－及 22－位、inonotusane A（3）的3－位均有進(jìn)一步研究的價值，但因他們均為樺褐孔菌的獨(dú)有成分，目前尚未發(fā)現(xiàn)其在其他天然產(chǎn)物中存在。因此，原料問題是其結(jié)構(gòu)修飾工作的關(guān)鍵之一。

天然化合物的結(jié)構(gòu)修飾往往是獲得理想活性物質(zhì)的一個有效手段，其中，三萜類化合物所表現(xiàn)出的廣泛的抗腫瘤活性使其成為重要的先導(dǎo)化合物來源，如對鼠纖維肉瘤細(xì)胞Meth－A、Lewis型肺癌細(xì)胞LLC、乳腺管癌細(xì)胞T－47D、惡性肉瘤細(xì)胞S180和肝癌細(xì)胞Hep G2等都具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能抑制肝癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12－15]。對于三萜類先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)修飾及抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系研究也受到關(guān)注，如同為羊毛脂烷型三萜的靈芝酸的抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系研究表明，靈芝酸A、F和H對乳腺癌細(xì)胞MDA－MB－231轉(zhuǎn)移的抑制作用，得出結(jié)論：C－3、C－7和 C－15 位置的羥基化有助于提高該類三萜結(jié)構(gòu)對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制活性[16]。

表2 化合物1-3、3a的13C-NMR數(shù)據(jù)（100 MHz）及3a的1H-NMR數(shù)據(jù)（400 MHz,δin ppm,Jin Hz）Tab.2 13C-NMR data of 1-3 and 3a(100 MHz)and 1H-NMR data of 3a(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

表 3 化合物 2、2a、3 和 3a 的 1H-NMR（400 MHz，δ in ppm,J in Hz）Tab.3 1H-NMR data of compounds 2,2a,3 and 3a(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

表4 化合物1-3、1（a-c）、2a和3a對受試腫瘤細(xì)胞的抑制作用Tab.4 IC50 of 1-3,1(a-c),2a and 3a on the tumor cell lines μmol/L

因此對樺褐孔菌三萜的結(jié)構(gòu)修飾及構(gòu)效關(guān)系研究任重而道遠(yuǎn)，也希望本研究能為抗腫瘤藥物的研究進(jìn)程貢獻(xiàn)新力量。