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    樺褐孔菌三萜的?;瘜ζ淇鼓[瘤活性的影響

    2018-11-16 07:51:02鄧麗穎楊燦宇閆亞輝李佳偉岑如月
    天津中醫(yī)藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:孔菌?;?/a>柱層析

    鄧麗穎,楊燦宇,閆亞輝,李佳偉,岑如月,趙 輝

    (1.河南省輝縣市人民醫(yī)院,輝縣 453600;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,開封 475004)

    樺褐孔菌[Inonotus obliquus(Fr.)Pilat]為擔(dān)子菌亞門、多孔菌目、刺革菌科的藥用真菌,在亞洲、歐洲及北美洲均有分布,它作為抗腫瘤藥物在民間使用已有很長歷史[1-2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗證明樺褐孔菌可抑制NCI-H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞、HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞及B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的生長,并可逆轉(zhuǎn)Hep2/R肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性[3-4]。樺褐孔菌的化學(xué)成分主要為羊毛脂烷型三萜類化合物[5-7],其中以 inotodiol和 trametenolic acid 2個化合物的含量最高,他們也是樺褐孔菌中眾多其他次生代謝產(chǎn)物的生物原料。本實(shí)驗擬從樺褐孔菌中分離制備inotodiol、trametenolic acid及抗腫瘤活性化合物inonotusane A,并以此為原料制備其酰化產(chǎn)物,進(jìn)而考察其結(jié)構(gòu)變化前后的抗腫瘤活性,為樺褐孔菌三萜的結(jié)構(gòu)修飾方向提供參考,inotodiol、trametenolic acid及inonotusane A的結(jié)構(gòu)見圖1。

    1 儀器與材料

    AVANCE400M核磁共振儀(1H HNMR:400MHz,13CNMR:100 MHz,德國 Bruker公司);高分辨質(zhì)譜(安捷倫公司);VERTEX70傅立葉變換紅外光譜儀(Bruker公司);XT6顯微熔點(diǎn)測定儀(北京市科技電光儀器廠);制備型高效液相色譜(HPLC)儀(日本島津),制備型HPLC色譜柱為Shim-pack PREP-ODS(H)KITcolumn(250 mm ×20 mm,5μm);十八烷基鍵合固定相(Rp-18)柱層析材料(Merck公司),Rp-18高效薄層預(yù)制板(Merck公司),柱色譜用硅膠200~300目(青島海洋化工廠);色譜甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司),本實(shí)驗所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

    本實(shí)驗所用藥材采自吉林省琿春地區(qū),由本實(shí)驗室鑒定為 Inonotus obliquus(Fr.)Pil。紫杉醇注射液(5 mL,30 mg)購自海南中化聯(lián)合制藥工業(yè)股份有限公司,批號20130806。

    2 實(shí)驗方法

    2.1 原料化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 取干燥粉碎的樺褐孔菌子實(shí)體10 kg,采用95%乙醇回流提取5次,每次1 h,得到乙醇提取物430.5 g。將乙醇提取物均勻分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃?。?5 L×3)得到各萃取物。將乙酸乙酯萃取物(198.2 g)用硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯)粗分為Fr.1~10共10部分。將餾分Fr.2再用硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯μ從100∶0到0∶100比例梯度洗脫)分離得到inotodiol(1);將餾分Fr.3也用硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯)分為 3 部分 Fr.3.1~3.3,進(jìn)而將Fr.3.1進(jìn)行ODS開放柱層析(甲醇-水)和制備型HPLC(甲醇∶水為77∶23)進(jìn)行分離,得到inonotusane A(3);將餾分 Fr.4 采用 ODS 開放柱層析分為 Fr.4.1~4.5,再將 Fr.4.3 采用硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水為 13∶0.95∶0.05) 分離,得到 trametenolic acid(2)。

    2.2 目標(biāo)化合物的制備 化合物1(a-c)的制備:稱取干燥的inotodiol(1)220 mg置于100 mL的圓底燒瓶中,加入約22 mL氯仿將化合物inotodiol溶解,另取506 mg的干燥琥珀酸酐,使用約8.8 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后,加入圓底燒瓶中,再加入吡啶10μL和4-二甲氨基吡啶(DMAP)適量,攪拌下加熱至回流約7 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)物反應(yīng)完全。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出氯仿后,加入蒸餾水30 mL,用稀 HCl調(diào) pH 2~3,再用乙酸乙酯(4×20 mL)萃取,合并乙酸乙酯萃取液,用70 mL飽和鹽水洗滌4次,再加入無水硫酸鈉干燥。次日,將有機(jī)相蒸干,硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水為 20∶0.95∶0.05)分離純化后,用制備型HPLC分離,分別得到化合物1a(甲醇∶水為 77∶23,tR164.8 min)、1b(甲醇∶水為 77∶23,tR65.5 min)和 1c(甲醇∶水為 84∶16,tR30.5 min)。

    化合物2a的制備:稱取干燥的trametenolic acid(2)320 mg置于100 mL的圓底燒瓶中,加入約10 mL吡啶將化合物trametenolic acid溶解,另取560 mg的干燥琥珀酸酐,用約10 mL DMF溶解后,加入圓底燒瓶中,再加入DMAP適量,攪拌下加熱至83℃,反應(yīng)約17 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)物反應(yīng)完全。將反應(yīng)液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸1h后,加入蒸餾水20mL,用稀 HCl調(diào) pH 2~3,再用乙酸乙酯(4×20 mL)萃取,合并乙酸乙酯萃取液,用70 mL飽和鹽水洗滌4次,再加入無水硫酸鈉干燥。次日,將有機(jī)相蒸干,ODS開放柱層析(甲醇∶水為90∶10)分離純化后,用硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水為 9∶0.95∶0.05)分離,得到化合物2a。

    化合物3a的制備:稱取干燥的inonotusane A(3)12 mg置于25 mL的圓底燒瓶中,加入約3 mL氯仿將化合物inonotusane A溶解,另取25 mg的干燥琥珀酸酐,用約1 mLDMF溶解后,加入圓底燒瓶中,再加入吡啶10μL和DMAP適量,攪拌下加熱至回流約10 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)物反應(yīng)完全。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出氯仿后,加入蒸餾水5 mL,用稀HCl調(diào)pH 2~3,再用乙酸乙酯(4×5 mL)萃取,合并乙酸乙酯萃取液,用20 mL飽和鹽水洗滌4次,再加入無水硫酸鈉干燥。次日,將有機(jī)相蒸干,制備型HPLC(甲醇∶水為95∶5)分離純化后,用硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水為 8∶0.95∶0.05)分離,得到化合物 3a。

    圖1 目標(biāo)化合物1(a-c)、2a和3a的合成路線Fig.1 Systhesisrouteof the objective compounds1(a-c),2a and 3a

    圖2 化合物3a的17-側(cè)鏈的NOESY相關(guān)情況Fig.2 Key NOESY correlations of 17-sidechain in 3a

    2.3 體外抗腫瘤活性 采用噻唑藍(lán)(MTT)法測試化合物 1-3 及 1a、1b、1c、2a、3a 對 A549 人肺癌、Hela人宮頸癌、MCF-7人乳腺癌及4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株的抑制活性。實(shí)驗中,受試化合物均用二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成10 mmol/L的母液,-20℃儲存,臨用前于37℃恒溫解凍后,采用不加血清的培養(yǎng)基將母液稀釋至不同濃度;對照品采用紫杉醇注射液,其中紫杉醇的濃度為7 mmol/L,將其按藥品說明書進(jìn)行儲存,臨用前采用不加血清的培養(yǎng)基將其稀釋至不同濃度。

    取對數(shù)生長期細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液后,將細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板中,每孔加入100μL,將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18~24 h;待細(xì)胞貼壁后,將培養(yǎng)基棄去,加入充分混勻的含有不同濃度藥物(待測化合物及陽性對照化合物)的培養(yǎng)基至96孔板中,每孔加入100μL,藥物濃度分別為 1、5、10、30、50 μmol/L,每種濃度設(shè)4個復(fù)孔,其中,調(diào)零組不接種細(xì)胞,空白組接種細(xì)胞但不加藥;將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h;將培養(yǎng)基吸出,每孔加入MTT試劑100μL,將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸出上清液,每孔加DMSO 100μL,振蕩 5~10 min,在酶聯(lián)免疫檢測儀 490 nm處測量各孔的吸光度值,計算腫瘤細(xì)胞的抑制率及化合物的IC50值。

    3 實(shí)驗結(jié)果

    化合物 1:白色粉末(1.2 g),ESI-MSm/z:465.57[M+Na]+,481.43[M+K]+,其1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)分別見表1和表2。通過與文獻(xiàn)報道對照,將其鑒定為inotodiol[8]。

    化合物 2:白色粉末(802 mg),ESI-MS m/z:455.62[M-H]-,其1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)分別見表 2 和表3。通過與文獻(xiàn)報道對照,將其鑒定為trametenolic acid[9]。

    化合物 3:白色粉末 (23 mg,tR43.7 min),HRESIMS確定其分子式為C30H50O3([M+Na]+,m/z 481.365 4;calcd 481.365 8),其1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)分別見表2和表3。通過與文獻(xiàn)報道對照,將其鑒定為inonotusane A[10]。

    化合物 1a:白色粉末(20 mg),回收率 7.4%,HRESIMS確定其分子式為C34H54O5([M+Na]+,m/z 565.386 8;calcd 565.386 9)。IR(KBr)νmax:3 450,2 924,1727,1454,1375,1166cm-1。1HNMR(400MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)見表1,經(jīng)與原料化合物1對照,并參考文獻(xiàn)[11],3-H 的化學(xué)位移由 δH3.24(dd,J=9.2,4.4 Hz)增大至 δH4.48(dd,J=9.2,7.2 Hz);同時,化合物1a增加了4個質(zhì)子信號δH2.59(4H,m)。13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:174.2,135.9,135.7,133.2,123.6,82.6,74.9,52.1,50.7,46.0,44.2,39.0,38.2,36.5,32.3,32.1,30.7,30.1,28.5,28.5,27.6,26.1,25.1,24.7,22.1,19.7,19.3,18.0,17.1,16.2,13.1。

    表 1 化合物 1 和 1(a-c)的 1H-NMR(400 MHz,δ in ppm,J in Hz)Tab.1 1H-NMR data of compounds1,1a,1b and 1c(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

    化合物 1b:白色粉末(30 mg),回收率 11.1%,HRESIMS確定其分子式為C34H54O5([M+Na]+,m/z 565.386 6;calcd 565.386 9)。IR(KBr)νmax:3 448,2 924,1 726,1 454,1377,1 169,1 058 cm-1。1H NMR(400 MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)見表1,經(jīng)與原料化合物1 對照,并參考文獻(xiàn)[11],22-H 的化學(xué)位移由 δH3.68(1H,m)增大至δH4.90(1H,m);同時,化合物1b增加了4 個質(zhì)子信號 δH2.55(4H,m)。13CNMR(100 MHz,CD3OD)δ:174.0,136.2,135.6,134.4,121.9,79.7,78.6,52.0,50.7,46.1,41.2,40.0,38.3,37.0,32.3,32.0,30.9,28.7,28.5,28.0,27.7,27.7,26.0,24.7,22.1,19.7,19.5,18.0,16.2,16.2,13.8。

    化合物 1c:白色粉末(103 mg),回收率 32.2%,HRESIMS確定其分子式為C38H58O8([M+Na]+,m/z 665.402 8;calcd 665.403 0)。IR(KBr)νmax:3 385,2 946,2 836,1 731,1 371,1 171,1 024 cm-1。1H NMR(400 MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)見表1,經(jīng)與原料化合物1對照,并參考文獻(xiàn)[11],3-H 的化學(xué)位移由 δH3.24(dd,J=9.2,4.4 Hz)增大至 δH4.48(dd,J=8.8,7.6 Hz),同時,22-H 的化學(xué)位移由 δH3.68(1H,m) 增大至 δH4.91(1H,m);此外,化合物 1c 增加了 8 個質(zhì)子信號δH2.57(8H,m)。13CNMR(100 MHz,CD3OD)δ:176.0,176.0,174.0,173.8,135.8,135.7,134.5,121.9,82.5,78.5,52.0,50.7,46.1,41.2,39.0,38.2,36.5,32.2,32.0,30.6,29.9,28.5,28.0,27.6,27.6,26.1,25.1,24.8,22.1,19.7,19.3,18.1,17.1,16.2,13.8。

    化合物 2a:白色粉末(150 mg),回收率 38.4%,HRESIMS 確定其分子式為 C34H52O6([M-H]-,m/z 555.368 8;calcd 555.368 6)。IR(KBr)νmax:2 950,1716,1657,1375,1266,1179cm-1。1HNMR(400MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)見表3,經(jīng)與原料化合物2對照,并參考文獻(xiàn)[11],3-H 的化學(xué)位移由 δH3.00(1H,m)增大至 δH4.39(1H,m);同時,化合物 2a 增加了 4 個質(zhì)子信號 δH2.50(4H,m)。13CNMR(100 MHz,CD3OD)δ:180.5,176.0,174.1,135.7,135.7,133.0,124.9,82.6,52.0,50.7,49.3,48.5,45.5,39.0,38.2,36.5,33.8,31.5,30.6,30.1,29.9,28.5,28.2,27.5,27.0,26.0,25.1,24.8,22.0,19.7,19.2,17.8,17.1,16.5。

    化合物 3a:白色粉末(4 mg),回收率 27.4%,mp 149.5~150.6 ℃,HRESIMS 確定其分子式為 C34H54O6([M+Na]+,m/z 581.381 7;calcd 581.381 8)。IR(KBr)νmax:3 436,2 952,1 645,1 452,1 372,1 160,1 017,667 cm-1。1H NMR(400 MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)見表 3,與原料化合物3對照顯示,3-H的化學(xué)位移由δH3.24(dd,J=11.6,4.4Hz)增大至 δH4.38(dd,J=8.8,7.2Hz);同時,化合物3a增加了4個質(zhì)子信號δH2.49(4H,m)。13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ:176.0,174.1,136.1,135.6,82.7,76.3,73.4,54.5,52.1,50.6,49.9,45.6,44.6,39.0,38.2,36.6,32.2,31.2,30.6,30.6,30.0,30.0,29.4,29.1,28.5,28.2,27.6,25.1,25.0,22.1,19.7,19.3,17.6,17.1。為證實(shí) inonotusane A(3)反應(yīng)生成3a后,其側(cè)鏈上的五元環(huán)構(gòu)型未發(fā)生變化,通過HSQC譜對目標(biāo)化合物3a的1H NMR和13C NMR進(jìn)行歸屬后(表2),進(jìn)一步分析其NOESY譜(圖 2)可見 H-17/H3-30相關(guān)峰,表明 H-17為 α-構(gòu)型;另外可見 H-21/H-20和H-21/H3-18相關(guān)峰,而未見H-20/H-17相關(guān)峰,證實(shí)了21β-H和22β-H;同時H-21/H-24相關(guān)峰證明H-24為β-構(gòu)型?;衔?1、2、3、1a、1b、1c、2a、3a的結(jié)構(gòu)見圖 1。

    MTT實(shí)驗結(jié)果如表4所示,化合物1的3-位、22-位酰化后(1a,1b,1c)對A549和4T1腫瘤細(xì)胞的抑制活性均增強(qiáng),此外,而其3-位?;螅?a)還大大增強(qiáng)了對MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制活性。化合物2?;髮钚詿o影響。化合物3的3-位?;髮549、MCF-7及4T1細(xì)胞的抑制活性均明顯增強(qiáng),其中對A549表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗腫瘤活性(IC50=9.53 μmol/L)。

    4 討論

    所有化合物在結(jié)構(gòu)修飾前后對HeLa細(xì)胞的抑制活性均未發(fā)生變化,而對其他腫瘤細(xì)胞的抑制活性卻明顯增強(qiáng)(2a除外),推測HeLa細(xì)胞對于化合物結(jié)構(gòu)中引入此類酰基并不敏感。2和2a對所有腫瘤細(xì)胞均無抑制活性,說明化合物的酰化并不能增強(qiáng)活性,應(yīng)嘗試其他的結(jié)構(gòu)修飾方式。1a、1b、1c和3a均比其原料化合物具更強(qiáng)的抗腫瘤活性,故inotodiol(1)的 3 位-及 22-位、inonotusane A(3)的3-位均有進(jìn)一步研究的價值,但因他們均為樺褐孔菌的獨(dú)有成分,目前尚未發(fā)現(xiàn)其在其他天然產(chǎn)物中存在。因此,原料問題是其結(jié)構(gòu)修飾工作的關(guān)鍵之一。

    天然化合物的結(jié)構(gòu)修飾往往是獲得理想活性物質(zhì)的一個有效手段,其中,三萜類化合物所表現(xiàn)出的廣泛的抗腫瘤活性使其成為重要的先導(dǎo)化合物來源,如對鼠纖維肉瘤細(xì)胞Meth-A、Lewis型肺癌細(xì)胞LLC、乳腺管癌細(xì)胞T-47D、惡性肉瘤細(xì)胞S180和肝癌細(xì)胞Hep G2等都具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,能抑制肝癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12-15]。對于三萜類先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)修飾及抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系研究也受到關(guān)注,如同為羊毛脂烷型三萜的靈芝酸的抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系研究表明,靈芝酸A、F和H對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移的抑制作用,得出結(jié)論:C-3、C-7和 C-15 位置的羥基化有助于提高該類三萜結(jié)構(gòu)對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制活性[16]。

    表2 化合物1-3、3a的13C-NMR數(shù)據(jù)(100 MHz)及3a的1H-NMR數(shù)據(jù)(400 MHz,δin ppm,Jin Hz)Tab.2 13C-NMR data of 1-3 and 3a(100 MHz)and 1H-NMR data of 3a(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

    表 3 化合物 2、2a、3 和 3a 的 1H-NMR(400 MHz,δ in ppm,J in Hz)Tab.3 1H-NMR data of compounds 2,2a,3 and 3a(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

    表4 化合物1-3、1(a-c)、2a和3a對受試腫瘤細(xì)胞的抑制作用Tab.4 IC50 of 1-3,1(a-c),2a and 3a on the tumor cell lines μmol/L

    因此對樺褐孔菌三萜的結(jié)構(gòu)修飾及構(gòu)效關(guān)系研究任重而道遠(yuǎn),也希望本研究能為抗腫瘤藥物的研究進(jìn)程貢獻(xiàn)新力量。

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