當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病大鼠肝臟、骨骼肌中PKC-ζ表達(dá)的影響*

艾 望，周 珍，張曼玲，王秀萍，張瑩雯

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430071）

2型糖尿?。═2DM）是由胰島素分泌和（或）功能缺陷所導(dǎo)致的以高血糖為特征的代謝性疾病，T2DM患者占中國糖尿病人口的90%以上[1]。胰島素抵抗在T2DM發(fā)病中起重要作用，并貫穿于T2DM全過程。蛋白激酶 C－ζ（PKC－ζ）是蛋白激酶 C（PKC）的一種亞型，屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，其結(jié)構(gòu)和功能與經(jīng)典PKC相比具有明顯的區(qū)別[2]。PKC－ζ屬于磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）下游信號分子，參與完成胰島素刺激的脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞攝取葡萄糖的最后生物學(xué)事件[3－5]。

課題組前期研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病大鼠有降低血糖、血脂以及心血管、腎臟、神經(jīng)等多種并發(fā)癥的保護(hù)作用，對核因子－κB（NF－κB）、轉(zhuǎn)化生長因子等多個(gè)靶點(diǎn)有抑制作用[6－9]。設(shè)想當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以通過調(diào)控PKC－ζ表達(dá)，從而達(dá)到改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血糖的作用。

本文旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從補(bǔ)氣生血的古典經(jīng)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯中探討其增加胰島素敏感性，改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級純系正常SD雄性大鼠50只，10周齡，200～220 g，購于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號：SCXK2008－0004]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 當(dāng)歸補(bǔ)血湯（黃芪∶當(dāng)歸＝2∶1）由武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房提供，黃芪、當(dāng)歸生藥浸水30 min，煎2次，混勻煎煮液，冷卻后放于4℃冰箱備用。吡格列酮片（卡司平）購自武漢大學(xué)中南醫(yī)院西藥房。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素（STZ），購于美國Sigma公司，溶于1%檸檬酸鈉緩沖液，pH 4．3；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（貨號E－ELR0023c）；PKC－ζ兔抗大鼠一抗購于 Abcam公司（批號ab59364）；HRP標(biāo)記山羊抗兔購于ASPEN（批號AS－1107）；DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購于Roche公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 穩(wěn)豪倍優(yōu)型強(qiáng)生血糖儀及血糖試紙，美國強(qiáng)生公司；倒置熒光顯微鏡IX51，OLYMPUS；普通光學(xué)顯微鏡 CX－21，OLYMPUS；成像系統(tǒng)MicroPublisher，Q－IMAGING；切片機(jī) RM2016，上海徠卡儀器有限公司。

2 方法

2.1 飼養(yǎng)條件 所有大鼠均在武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。室溫（22±2）℃、相對濕度（55±5）%、光照周期12～12 h。實(shí)驗(yàn)期間保證所有大鼠飲水、標(biāo)準(zhǔn)飲食充足，定時(shí)更換墊料。

2.2 模型制備與分組給藥 50只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取20只大鼠分為空白對照組（n=10）和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組（n=10），給予普通飼料飼養(yǎng)。余30只給予高脂高糖飼料飼養(yǎng)，4周后，禁食12 h，注射小劑量STZ（35 mg/kg），空白對照組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組給予等量檸檬酸鈉緩沖液，72 h后尾靜脈取血測血糖，大鼠血糖≥16．7 mmol/L即為造模成功，可納入實(shí)驗(yàn)[10]。測得30只大鼠全部造模成功，隨機(jī)分為T2DM模型組（n=10）、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組（n=10）、T2DM+吡格列酮組（n=10）。對空白對照組和T2DM模型組給予生理鹽水5 mL/（kg·d）灌胃，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯3．57 g/（kg·d）灌胃，T2DM+吡格列酮組給予吡格列酮10 mg/（kg·d）灌胃。所有大鼠連續(xù)給藥和觀察5周后取材。

2.3 一般情況 觀察大鼠飲水量、進(jìn)食量、尿量、精神、毛色、反應(yīng)力等并作記錄。

2.4 體質(zhì)量、血糖、血清胰島素測定 所有組每周末測大鼠體質(zhì)量，采用眼內(nèi)眥靜脈取血測空腹血糖及空腹胰島素含量。血糖儀及配套試紙測定各組大鼠空腹血糖（FPG），ELISA法測大鼠血清空腹胰島素（FINS）。

2.5 免疫組化檢測 無菌條件下取肝臟和骨骼肌，用4%多聚甲醛固定，將組織石蠟包埋切片。再將切片經(jīng)過脫蠟至水、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次、新鮮配置的乙二胺四乙酸（EDTA）修復(fù)液修復(fù)、冷卻、PBS洗3次、3%H2O2溶液避光孵育10 min、5%BSA封閉、加一抗、復(fù)溫、洗去一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、洗去二抗、DAB顯色、Mayer蘇木素復(fù)染、脫水透明封片。將封固好的切片晾干后，置于倒置顯微鏡用200倍視野選取視野，每個(gè)組織片選取3個(gè)200倍視野來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Image Pro－Plus 6．0軟件分析免疫組化圖片方法：每組內(nèi)每張切片分別隨機(jī)挑選3個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。讓組織充滿整個(gè)視野再進(jìn)行拍照。對每張照片應(yīng)用Image－Pro Plus 6．0軟件進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD值）。IOD值越大，表示陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。造模成功后糖尿病大鼠進(jìn)水量、攝食量、尿量明顯增加，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，皮毛凌亂，色澤暗淡。這些情況在T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和T2DM+吡格列酮組得到明顯改善。

3.2 體質(zhì)量變化、FPG和FINS 灌胃后空白對照組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；T2DM模型組、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組糖尿病大鼠體質(zhì)量低于空白對照組（P＜0．05）；T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組體質(zhì)量高于T2DM 模型組（P＜0．05）。

灌胃后空白對照組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組FPG、FINS濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；T2DM模型組、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組大鼠FPG、FINS高于空白對照組（P＜0．05）；T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組FPG、FINS濃度較T2DM模型組下降（P＜0．05），且T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和T2DM+吡格列酮組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 灌胃后各組大鼠體質(zhì)量變化、FPG和FINS濃度（x±s）Tab.1 Changes of body weight,fasting blood glucoseand fasting insulin concentrations of rats in each group after gavage（x±s）

3.3 肝臟、骨骼肌組織中PKC－ζ表達(dá) 圖像分析系統(tǒng)檢測肝臟組織和骨骼肌組織中PKC－ζ表達(dá)情況：肝臟和骨骼肌組織各組之間PKC－ζ表達(dá)趨勢相同?？瞻讓φ战M與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞上PKC－ζ廣泛分布，呈棕黃色，強(qiáng)陽性，且空白對照組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組無明顯區(qū)別；T2DM模型組、T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組表達(dá)量低于空白對照組（P＜0．05）；T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、T2DM+吡格列酮組較T2DM模型組表達(dá)量升高（P＜0．05），且T2DM+當(dāng)歸補(bǔ)血湯組與T2DM+吡格列酮組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2、圖1、圖2。

表2 各組肝臟、骨骼肌IOD值（x±s）Tab.2 IOD value of liver and skeletal muscle in each group（x±s）

4 討論

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，《外臺秘要》記載：“渴而飲水多，小便數(shù)……甜者，皆是消渴病也?！毕实幕静C(jī)是陰虛燥熱：初期為陰津虧損，漸至陰傷及氣，出現(xiàn)氣陰兩虛，氣虛則運(yùn)血、生血無力，以致血虛燥熱，陰虛為本，燥熱為標(biāo)，互為因果，病發(fā)消渴。因此，消渴的治療重在補(bǔ)氣養(yǎng)陰生血。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯作為補(bǔ)氣生血的代表方，始載于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，全方由黃芪、當(dāng)歸以5∶1的比例組成，主治“血虛發(fā)熱”證候。在臨床工作中，研究者將當(dāng)歸補(bǔ)血湯應(yīng)用于糖尿病及并發(fā)癥治療近30年，發(fā)現(xiàn)根據(jù)糖尿病所處不同階段，調(diào)整原方中黃芪、當(dāng)歸比例，可取得更好的臨床療效。故本研究加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯是以李東垣所創(chuàng)制的當(dāng)歸補(bǔ)血湯為基方，加大當(dāng)歸的用量，調(diào)整黃芪、當(dāng)歸用量之比為2∶1。黃芪健脾益氣，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，則陽生陰長，氣旺血生，虛熱自退。

PKC－ζ在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)控基因表達(dá)、影響免疫功能、參與代謝調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種作用。在靜息狀態(tài)下，PKC以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)存在外界刺激時(shí)（如高糖狀態(tài)），受其特異性底物吸引由胞液向胞膜轉(zhuǎn)移，通過多種膜蛋白的磷酸化作用使其構(gòu)象改變，致使PKC信號通路激活，但PKC－ζ轉(zhuǎn)位機(jī)制目前仍未十分明確[11]。近年來，關(guān)于PKC－ζ在糖尿病中的作用研究逐步深入，許多報(bào)道證實(shí)其與胰島素抵抗的形成關(guān)系密切。T2DM的胰島素抵抗屬獲得性胰島素抵抗，主要由胰島素受體后因素導(dǎo)致，包括胰島素受體底物1（IRS－1）磷酸化障礙、PI3K活化障礙、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（GLUT4）合成與轉(zhuǎn)位異常、細(xì)胞內(nèi)葡萄糖磷酸化障礙等[12－13]。PKC－ζ改善胰島素抵抗可能是通過促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白GLUT－4的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)的：當(dāng)胰島素與受體結(jié)合后，激活I(lǐng)RS－1/2，進(jìn)一步激活經(jīng)典PI3K－PIP3－PDK1 通路，從而激活 PKC－ζ，PKC－ζ通過誘導(dǎo) GLUT4轉(zhuǎn)位，參與胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)胰島素將血糖轉(zhuǎn)運(yùn)至肌肉、脂肪組織及肝臟中。有研究發(fā)現(xiàn)活化的PKC－ζ刺激GLUT4轉(zhuǎn)位，而失活的PKC－ζ則部分抑制GLUT4轉(zhuǎn)位，PKC－ζ抑制劑還可阻斷岡田軟海綿酸刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)位[14]。

圖1 各組大鼠肝臟中PKC-ζ的表達(dá)Fig.1 Expression of PKC-ζin the liver of rats in each group

圖2 各組大鼠骨骼肌中PKC-ζ的表達(dá)Fig.2 Expression of PKC-ζin skeletal muscle of ratsin each group

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，造模成功后，T2DM大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿、體質(zhì)量減輕、血糖升高、胰島素濃度升高等異常，而經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療后的大鼠“三多一少”癥狀明顯好轉(zhuǎn)，F(xiàn)PS、FINS濃度顯著降低，且與西藥吡格列酮療效無明顯差異，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯可改善胰島素抵抗，降低血糖。免疫組化T2DM大鼠肝臟、骨骼肌組織中PKC-ζ的表達(dá)明顯減少，而經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療后，PKC-ζ表達(dá)量增加，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)節(jié)血糖的作用可能與其促進(jìn)肝臟、骨骼肌組織中PKC-ζ的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。