剩余胚胎來源的囊胚凍融移植周期臨床結(jié)局分析

鄒敏，李姣，邵淑敏，胡廉，張潔，張玲*

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430010；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計(jì)劃生育研究所/生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430010)

隨著胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)的逐漸成熟，囊胚培養(yǎng)在輔助生殖技術(shù)中應(yīng)用日益廣泛。然而全部胚胎行囊胚培養(yǎng)仍存在無囊胚形成的風(fēng)險(xiǎn)，因此不少生殖中心對(duì)新鮮周期D3卵裂期胚胎的處理策略為根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分將最優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植和/或冷凍，然后將剩余的胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以篩選出更具發(fā)育潛能的胚胎，提高胚胎利用率。臨床研究數(shù)據(jù)已經(jīng)證明囊胚移植可提高胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率以及降低早期流產(chǎn)率[1-2]。那么這些剩余胚胎培養(yǎng)形成的囊胚發(fā)育能力又如何呢？本研究回顧性分析2015年1月至2017年12月本中心年齡<36歲的患者凍融移植周期臨床資料，對(duì)比分析剩余胚胎來源的D5、D6囊胚及D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率，探討剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)所形成的囊胚的發(fā)育潛能，同時(shí)為凍融移植周期胚胎的選擇提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

2015年1月至2017年12月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行凍融胚胎移植的患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡<36歲；(2)移植的D3胚胎均為優(yōu)質(zhì)胚胎；(3)移植的囊胚符合以下條件：來源于D3移植和/或冷凍了形態(tài)學(xué)評(píng)分最優(yōu)質(zhì)胚胎后剩余的正常受精胚胎、D3胚胎卵裂球數(shù)≥4，D5或者D6囊胚形成評(píng)分≥3CC者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：夫妻任何一方染色體異常及女方子宮畸形患者。

共納入993個(gè)凍融移植周期，其中172個(gè)周期移植D5囊胚、111個(gè)周期移植D6囊胚、710個(gè)周期移植D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。

二、方法

1.胚胎培養(yǎng)：采用商品化的G-seriesTM培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)對(duì)胚胎進(jìn)行序貫培養(yǎng)，受精卵置于G-1TMPLUS液滴中培養(yǎng)，至D3移植和/或冷凍質(zhì)量最優(yōu)質(zhì)的胚胎后剩余的≥4細(xì)胞的所有正常受精胚胎轉(zhuǎn)至 G-2TMPLUS液滴中培養(yǎng)至D5/D6。

2.胚胎冷凍及復(fù)蘇：所有胚胎的冷凍及復(fù)蘇嚴(yán)格按照玻璃化冷凍及復(fù)蘇試劑盒(KITAZATO，日本)說明書操作，僅在平衡時(shí)間及洗滌時(shí)間稍作改進(jìn)。囊胚冷凍前需激光打孔皺縮，除此之外囊胚與D3卵裂期胚胎冷凍及復(fù)蘇操作步驟均相同。冷凍過程分兩步：胚胎于1#平衡液(ES)中平衡6 min；轉(zhuǎn)至2#玻璃化冷凍液(VS)中，快速裝桿，該步驟應(yīng)該在1 min內(nèi)完成。復(fù)蘇過程為4步：胚胎于37℃預(yù)溫的1#解凍液(TS)中迅速?gòu)?fù)溫，該過程在1 min內(nèi)完成；復(fù)溫的胚胎先后置于2#稀釋液(DS)3 min、3#洗滌液(WS)5 min、4#WS 2 min。

3.胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)Peter評(píng)分系統(tǒng)對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行評(píng)分[3]。Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻，無顆?，F(xiàn)象，碎片<10%；Ⅱ級(jí)：卵裂球大小稍不均勻，形狀稍不規(guī)則，胞質(zhì)有顆?，F(xiàn)象，碎片在10%～20%之間；Ⅲ級(jí)：卵裂球不均勻，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)有明顯顆粒現(xiàn)象，碎片在20%～50%之間；Ⅳ級(jí)：卵裂球嚴(yán)重不均勻，形狀嚴(yán)重不規(guī)則，胞質(zhì)有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片>50%。D3優(yōu)質(zhì)胚胎為卵裂球數(shù)目≥6個(gè)的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎。(2)按照Gardner評(píng)分系統(tǒng)對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分[4]。先根據(jù)囊胚腔的大小和孵出程度將囊胚分成1～6期，然后對(duì)其中3～6期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)外胚層(TE)按細(xì)胞數(shù)目及排列進(jìn)行評(píng)分：A級(jí)(細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密)、B級(jí)(細(xì)胞數(shù)目較少，排列松散)、C級(jí)(細(xì)胞數(shù)目極少)。期別≥3期且ICM及TE評(píng)分均≥B級(jí)的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚；期別≥3期且ICM及TE其中任何一類細(xì)胞群評(píng)分≥B級(jí)的囊胚為可利用囊胚；ICM及TE評(píng)分均為C的囊胚或者D6形成的期別<3期者為劣質(zhì)囊胚。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備方法：(1)自然周期：在月經(jīng)周期第8～10天起B(yǎng)超監(jiān)測(cè)卵泡和內(nèi)膜發(fā)育情況，當(dāng)卵泡最大直徑≥14 mm監(jiān)測(cè)排卵，LH峰后肌注黃體酮；排卵后3～4 d行卵裂期胚胎移植或排卵后5 d行囊胚移植。(2)人工周期：在月經(jīng)周期第3天開始使用戊酸雌二醇(Delpharm Lille，法國(guó))，10 d后每隔3～5 d行B超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm肌注黃體酮，3～4 d后行卵裂期胚胎移植或5 d后行囊胚移植；(3)降調(diào)+人工周期：在月經(jīng)第2天皮下注射短效GnRH激動(dòng)劑(Ferring，德國(guó))，28～30 d測(cè)量血清E2及LH水平，判斷是否達(dá)成降調(diào)，B超評(píng)估內(nèi)膜厚度。符合條件者開始人工周期方案。

5.胚胎移植：使用移植管(COOK，美國(guó))及氣密注射器(COOK，美國(guó))一段式裝管后，超聲引導(dǎo)下于子宮腔中后部推出胚胎。

三、觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

總結(jié)分析患者一般資料、助孕過程指標(biāo)及臨床結(jié)局。

囊胚形成率：形成的囊胚數(shù)/用于囊胚培養(yǎng)的D3卵裂期胚胎數(shù)×100%；可利用囊胚率：可利用的囊胚數(shù)/形成的囊胚數(shù)×100%；種植率：B超顯示孕囊個(gè)數(shù)/移植胚胎個(gè)數(shù)×100%；臨床妊娠率：B超顯示有孕囊的移植周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率：早期流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，早期流產(chǎn)為B超顯示有孕囊后臨床確認(rèn)胚胎停育或者異位妊娠者。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、新鮮周期剩余D3胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成情況

基于新鮮周期D3移植和/或冷凍最優(yōu)質(zhì)胚胎后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)的囊胚培養(yǎng)策略，本中心2015年1月至2017年12月共有6 562枚D3剩余胚胎用于囊胚培養(yǎng)，囊胚形成率為53.75%(3 527/6 562)，可利用率為67.54%(2 382/3 527)。

二、各組患者基本情況比較

根據(jù)凍融移植周期中移植胚胎的來源，將患者分為3組：D5囊胚組、D6囊胚組和D3卵裂期胚組。三組間女方年齡、不孕年限、不孕因素、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者基本情況比較[(-±s)，n(%)]

注：組間相互比較，*P<0.05

三、各組臨床結(jié)局比較

D3移植和/或冷凍最優(yōu)質(zhì)胚胎后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)形成的囊胚凍融移植周期的總臨床妊娠率為62.54%、種植率為45.51%。

1.三組臨床結(jié)局比較：D5囊胚、D6囊胚及D3卵裂期胚三組間復(fù)蘇率、平均移植胚胎個(gè)數(shù)及早期流產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；D5囊胚組移植的優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)顯著高于D6囊胚組(P<0.05)；D5囊胚組臨床妊娠率及種植率顯著高于D6囊胚組和D3卵裂期胚組(P<0.05)；D6囊胚組臨床妊娠率及種植率與D3卵裂期胚組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

2.相同質(zhì)量D5囊胚與D6囊胚移植臨床結(jié)局比較：均為優(yōu)質(zhì)囊胚時(shí)，D5囊胚組臨床妊娠率及胚胎種植率均顯著高于D6囊胚組(P<0.05)；當(dāng)移植的2枚胚胎其中1枚為優(yōu)質(zhì)囊胚另外1枚為非優(yōu)質(zhì)可利用囊胚(優(yōu)質(zhì)+非優(yōu)質(zhì)可利用囊胚)時(shí)，D5囊胚組種植率顯著高于D6囊胚組(P<0.05)，而臨床妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；均為非優(yōu)質(zhì)可利用囊胚時(shí)，D5囊胚組臨床妊娠率及種植率均高于對(duì)應(yīng)質(zhì)量的D6囊胚，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；移植的2枚胚胎中至少包含1枚劣質(zhì)囊胚的情況，數(shù)據(jù)較少，未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表3)。

表2 三組凍融胚胎移植臨床妊娠結(jié)局比較[(-±s)，n(%)]

注：與D6囊胚組比較，*P<0.05；與其他兩組比較，#P<0.05

表3 相同質(zhì)量D5囊胚及D6囊胚移植的臨床結(jié)局比較[n(%)]

注：與對(duì)應(yīng)質(zhì)量D6囊胚組比較，*P<0.05

討 論

目前臨床根據(jù)D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分判斷胚胎的發(fā)育潛能，然而實(shí)踐顯示形態(tài)學(xué)指標(biāo)并不可靠，即使D3非優(yōu)質(zhì)胚胎也有可能形成囊胚。囊胚培養(yǎng)是更為可靠的胚胎篩選的手段。Kaartinen等[5]回顧性分析發(fā)現(xiàn)，按照標(biāo)準(zhǔn)需要廢棄處理的D3劣質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚后冷凍，復(fù)蘇后移植獲得24.6%的臨床妊娠率及17.2%分娩率。王雅琴等[6]的研究顯示D3卵裂球數(shù)在3～5個(gè)、胚胎碎片在5%～20%的胚胎行囊胚培養(yǎng)，囊胚形成率為33.6%，凍融移植周期臨床妊娠率為40.5%。另有研究顯示發(fā)育遲緩的D3胚胎囊胚形成率低于發(fā)育速度正常的D3胚胎，但是其形成的囊胚凍融移植周期臨床妊娠率、種植率、孕周數(shù)及新生兒體重均與D3發(fā)育速度正常的胚胎形成的囊胚無顯著差異[7]。因此對(duì)于這部分D3形態(tài)學(xué)評(píng)分較差的胚胎，囊胚培養(yǎng)可篩選出具有發(fā)育潛能的胚胎，從而避免胚胎的浪費(fèi)，提高胚胎利用率。本研究結(jié)果證實(shí)，包括非優(yōu)質(zhì)胚胎及D3移植和/或冷凍形態(tài)學(xué)評(píng)分最優(yōu)質(zhì)的胚胎后剩余的次優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成率為53.75%，且67.54%的囊胚為可利用囊胚，極大地提高了胚胎的利用率。

有研究顯示剩余胚胎培養(yǎng)所形成的囊胚具有極大的發(fā)育潛能，凍融周期其臨床結(jié)局優(yōu)于D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。Shaw-Jackson等[8]將碎片≥20%、D3發(fā)育較慢(<6細(xì)胞)、胞漿內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的顆?，F(xiàn)象、存在空泡、透明帶異常、D2發(fā)育較快(>6細(xì)胞)、D2為3個(gè)均勻的卵裂球等非優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)形成的囊胚在凍融移植周期的臨床妊娠率、種植率均高于D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。許麗娟等[9]研究結(jié)果也顯示D3優(yōu)良胚胎冷凍后剩余的非優(yōu)良胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，凍融移植周期D5囊胚臨床結(jié)局優(yōu)于D3優(yōu)良胚胎及D6囊胚。他們用于囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)良胚胎包括細(xì)胞數(shù)≥4、碎片≤20%的2PN非優(yōu)良胚胎，D2到D3發(fā)育阻滯的胚胎，正常發(fā)育的0PN或1PN胚胎。本研究結(jié)果與其一致，剩余胚胎形成的囊胚凍融移植周期臨床妊娠率為62.54%、種植率為45.51%。其中D5囊胚臨床妊娠率及種植率明顯高于D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎和D6囊胚，而D6囊胚臨床妊娠率及種植率與D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的臨床結(jié)局相當(dāng)。

剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)獲得良好臨床結(jié)局的原因可能在于：首先，部分發(fā)育潛能較差的卵裂期胚胎因不能形成囊胚而在囊胚培養(yǎng)過程中被淘汰；其次，囊胚的染色體正常率高于D3卵裂期胚胎，研究顯示卵裂期胚胎中大約70%存在染色體異常的可能[10-11]，而囊胚染色體異常率降至約40%[12-13]。D3形態(tài)學(xué)評(píng)分為優(yōu)質(zhì)的胚胎也有染色體異常的可能[14]，囊胚培養(yǎng)可以篩除一部分異常胚胎；最后，正常生理狀態(tài)下卵裂期胚胎在輸卵管內(nèi)移動(dòng)，直到發(fā)育至囊胚才進(jìn)入子宮腔內(nèi)，因此囊胚移植更符合生理狀態(tài)，與子宮內(nèi)膜的同步性更好。因此D3剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)一旦形成可利用囊胚，也可獲得良好的臨床結(jié)局。

D5囊胚臨床結(jié)局優(yōu)于D6囊胚，推測(cè)原因?yàn)槟遗甙l(fā)育速度的影響[15-16]。與D5囊胚相比，D6囊胚發(fā)育相對(duì)滯后，可能意味著胚胎質(zhì)量更差或者存在異常的可能性更高[17]。本研究納入的凍融移植周期中D5囊胚組的質(zhì)量顯著優(yōu)于D6囊胚組，我們?yōu)榇诉M(jìn)一步對(duì)比分析了相同質(zhì)量的D5囊胚與D6囊胚臨床結(jié)局：優(yōu)質(zhì)D5囊胚臨床妊娠率及胚胎種植率均明顯高于優(yōu)質(zhì)D6囊胚；當(dāng)移植的2枚胚胎其中1枚為優(yōu)質(zhì)囊胚另外1枚為非優(yōu)質(zhì)可利用囊胚時(shí)，D5囊胚種植率明顯高于D6囊胚，臨床妊娠率則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；非優(yōu)質(zhì)可利用D5囊胚臨床妊娠率及種植率均高于對(duì)應(yīng)質(zhì)量的D6囊胚，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與武龍梅等[18]的研究結(jié)果一致，他們的研究顯示優(yōu)質(zhì)D5囊胚臨床結(jié)局顯著優(yōu)于D6囊胚。而譚巧等[19]的研究結(jié)果則顯示凍融移植周期優(yōu)質(zhì)D5囊胚與優(yōu)質(zhì)D6囊胚臨床結(jié)局無顯著差異，非優(yōu)質(zhì)D5囊胚臨床結(jié)局優(yōu)于對(duì)應(yīng)質(zhì)量的D6囊胚。雖然不同的研究得到的結(jié)果不完全一致(可能與研究數(shù)據(jù)均偏少有關(guān))，但是所有的研究均顯示D5囊胚臨床結(jié)局優(yōu)于D6囊胚，僅僅具體到不同質(zhì)量時(shí)有些質(zhì)量的D5囊胚臨床妊娠率和/或種植率稍高于D6囊胚而無顯著性差別。

綜上所述，新鮮周期D3移植和/或冷凍后剩余的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，可獲得良好的囊胚形成率；所形成的囊胚在凍融移植周期中也可獲得良好的妊娠結(jié)局；D5形成的囊胚具有更高的發(fā)育潛力，復(fù)蘇時(shí)可優(yōu)先選擇，以便患者在最少的移植周期獲得臨床妊娠。