PAX6基因rs667773和rs3026354位點多態(tài)性與精神分裂癥臨床癥狀的相關性研究*

丁 玉 楊建立 韓海斌

精神分裂癥（Schizophrenia）是精神科常見的病因未明的精神疾病，與精神分裂癥相關的諸多研究假說中，神經(jīng)發(fā)育異常假說與精神分裂癥關系密切［1，2］。假說表明早期腦部損傷歷經(jīng)了正常的神經(jīng)發(fā)育過程后若附加應激刺激，可能會導致精神分裂癥的發(fā)?。?，4］。有研究表明PAX6基因在大腦神經(jīng)發(fā)育中有著重要作用，PAX6基因突變或缺失會影響海馬神經(jīng)發(fā)生，對精神分裂癥患者的研究也發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者的海馬神經(jīng)發(fā)生異常［5～7］。PAX6基因被敲除的鼠會出現(xiàn)類似精神分裂癥樣的表現(xiàn)，人類與嚙齒動物的PAX6基因編碼區(qū)域具有高度相似性［8～10］。本研究采用病例對照的研究方法，進一步分析PAX6基因2個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點多態(tài)性與精神分裂癥的發(fā)病機制及相關臨床癥狀間是否存在關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2012年5月～2013年5月在天津市安定醫(yī)院接受系統(tǒng)治療的首發(fā)精神分裂癥患者納入患者組。符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版（DSM－IV）精神分裂癥的診斷標準，由2名以上精神科醫(yī)師獨自完成，患者治療前用陽性和陰性綜合征量表（PANSS）評定相關臨床癥狀。共入組262例，其中男145例，女117例；漢族；年齡18～45歲，平均（29.4±6.5）歲；右利手。對照組選取與患者組各方面相匹配的健康志愿者318名，其中男187名，女131名；漢族；年齡18～45歲，平均（30.3±6.7）歲；右利手。一般健康問卷各項目總分＜30分，需排除家族中有精神疾病及自殺者，入選個體之間無血緣關系。兩組均排除腦器質性疾病及其他軀體疾病病史，排除精神活性物質濫用或依賴史，研究對象均來自中國淮河以北。入組患者的監(jiān)護人及健康志愿者在了解本研究以后，簽知情同意書。兩組性別、年齡的分布比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證實本研究中兩組研究對象的性別及年齡匹配。

1.2 方法

1.2.1 標本收集與基因組DNA提取 對符合入選標準的對象，擇時采肘靜脈血10 ml，用EDTA作為抗凝劑進行充分抗凝，離心后放置于－80℃低溫冰箱保存，為提取DNA備用。本研究提取人類基因組DNA采用的是AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點選擇、引物及探針設計合成 仔細檢索HapMap數(shù)據(jù)庫查找PAX6基因34 kb相關的區(qū)域，挑選位于PAX6的3’非翻譯區(qū)的2個標簽SNPs位點rs667773、rs3026354。遺傳標記確定之后，使用Primer Premier 5 PCR引物設計程序設計引物，每個連接酶檢測反應（LDR）位點均需設計3條探針，可以和特異性探針相鏈接進而更好地識別該位點的等位基因。

1.2.3 基因組DNA聚合酶鏈式反應（PCR） 擴增SNP位點所在的片段，在PCR擴增產(chǎn)物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應的模板，準備連接反應MIX體系 （10μl）。在 Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上設置程序：95℃變性 2 min，94℃ 30 s、50℃2 min（35個循環(huán)）。各取1μl ABIGS-500 ROX熒光標記分子量標準、1μl去離子甲酰胺上樣液和1 μl LDR連接產(chǎn)物混合，95℃加熱變性2 min后放置在冰中驟冷；在5 mol／L尿素和5%聚丙烯酰胺中進行3 000 V電泳2.5 h，應用Genemapper軟件進行相關的基因分型及數(shù)據(jù)處理。將剩余的樣品繼續(xù)放置于－20℃保存。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。采用SHEsis遺傳分析軟件進行H-W平衡檢驗，采用χ2檢驗進行組間基因型和等位基因分布頻率比較；本研究將檢驗水平定為P＜0.05。采用方差分析對rs667773、rs3026354位點各基因型PANSS量表評分進行比較。

2 結果

2.1 基因型與等位基因分析

2.1.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 患者組和對照組SNPs rs667773基因分布都符合H-W平衡定律（χ21＝0．026，P1＞0．05；χ22＝3．327，P2＞0．05），患者組和對照組SNPs rs3026354基因分布也都符合H-W平衡定律（χ21＝1．116，P1＞0．05；χ22＝1．403，P2＞0.05），證實本研究的樣本有群體代表性。

2.1.2 兩組SNPs rs667773、rs3026354基因型、等位基因頻率分布 患者組和對照組rs667773基因型及等位基因的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（基因型：χ2＝2．333，P＞0.05；等位基因：χ2＝0．096，P＞0．05）。患者組和對照組rs3026354基因型及等位基因的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（基因型：χ2＝9．316，P＜0.05；等位基因：T＞C，χ2＝8．371，P＜0．05）。見表1、表2。

表1 兩組SNPs rs667773位點基因型及等位基因分布比較［n（%）］

表2 兩組SNPs rs3026354位點基因型及等位基因分布比較［n（%）］

2.1.3 SNPs rs667773、rs3026354位點的連鎖不平衡（LD）分析 對SNPs rs667773、rs3026354兩個位點的LD情況進行分析結果為D’值為1，r2值為0.861，顯示這2個位點間有著很強的LD。對2個位點構成的單體型分析結果表明，患者組和對照組之間的單體型rs3026354C／rs667773T，rs3026354T／rs667773T頻率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 SNPs rs667773、rs3026354位點與精神分裂癥臨床癥狀分析

2.2.1 患者組SNPs rs667773不同基因型患者的臨床癥狀分析 通過比較患者組SNPs rs667773位點不同基因型PANSS陽性癥狀分、陰性癥狀分和一般精神病理因子分，顯示評分差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 患者組SNPs rs667773位點不同基因型的臨床癥狀分析（）

表3 患者組SNPs rs667773位點不同基因型的臨床癥狀分析（）

PANSS CC CT TT F值 P值陽性癥狀 20.70±4.35 21.61±4.71 22.00±3.24 1.367 0.257陰性癥狀 24.23±6.69 24.73±6.95 22.89±6.19 0.359 0.699一般精神病理因子 40.23±7.17 40.17±5.97 38.44±7.58 0.290 0.748

2.2.2 患者組SNPs rs3026354不同基因型的臨床癥狀分析 通過比較患者組的SNPs rs3026354位點不同基因型PANSS陽性癥狀分、陰性癥狀分和一般精神病理因子分，結果顯示陰性癥狀評分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中 TT型高于 CC型和 CT型（P＜0.05）。見表 4。）

表4 患者組SNPs rs3026354位點不同基因型的臨床癥狀分析（

表4 患者組SNPs rs3026354位點不同基因型的臨床癥狀分析（

注：與TT型比較，*P＜0.05

PANSS CC CT TT F值 P值陽性癥狀 20.94±4.06 20.98±4.52 21.06±4.48 0.013 0.987陰性癥狀 22.76±3.87*23.37±4.61*25.14±4.23 4.656 0.021一般精神病理因子 39.88±7.35 40.07±6.60 40.97±7.82 0.551 0.577

3 討論

目前精神分裂癥（Schizophrenia）已發(fā)展成全球社會經(jīng)濟負擔最重的疾病之一，可表現(xiàn)為情感思維及行為的分裂，個體精神活動和周圍環(huán)境不協(xié)調，有研究表明，在所有精神分裂癥患者中，大部分會出現(xiàn)多個陰性癥狀，相對于幻覺妄想等陽性癥狀來說，陰性癥狀對患者的預后更為重要［1，2］。相關調查報告顯示，該病在不同地區(qū)和不同國家的發(fā)病率比較接近，全世界大約有0.5% ～0.8%的人口患有該疾?。?1，12］。研究表明若患者在幼年大腦髓鞘形成期發(fā)生神經(jīng)發(fā)育異?？赡軙a(chǎn)生精神分裂癥的癥狀［13］。隨著神經(jīng)發(fā)育假說研究的進展，發(fā)現(xiàn)基因的變異在神經(jīng)發(fā)育生長異常中有重要作用。近年來分子遺傳學技術快速發(fā)展，關于精神分裂癥和不同基因的研究屢屢出現(xiàn)，如DISC1基因、ERBB4基因等［14～16］。因此尋找和精神分裂癥發(fā)病有密切聯(lián)系的基因位點非常重要。

目前研究表明PAX基因家族在生物胚胎發(fā)育中扮演重要角色，PAX基因家族有PAX1到PAX9共9個不同的成員。PAX6基因由于序列和功能的高度保守性，是目前該基因家族中被研究最為廣泛的基因。PAX6位于人染色體第11號染色體長臂13位點（11P13），小鼠2號染色體，基因全長22 kb，mRNA全長2.7 kb，cDNA全長1 269 bp［17］。PAX6基因在大腦發(fā)育中起著不可替代的作用［18］，若在大腦皮層發(fā)育期出現(xiàn)PAX6的缺陷，極可能會造成皮層、皮層間和皮層內連接嚴重缺損［7］，有動物研究證實鼠的穹窿海馬傘連接區(qū)PAX6被敲除會引起該區(qū)嚴重無序，出現(xiàn)海馬依賴的記憶缺陷的功能缺失［19，20］，這也可能是人和鼠出生后產(chǎn)生認知缺損的基礎。相關研究表明海馬神經(jīng)發(fā)生和精神分裂癥有密切的關系［21］。還有文獻指出PAX6參與調節(jié)邊緣腦區(qū)絡絲蛋白（Rein）的神經(jīng)發(fā)生，在對精神分裂癥患者的尸檢中可以發(fā)現(xiàn)，Rein在端腦特定區(qū)域表達大幅下降，Rein對大腦突觸可塑性、學習記憶起著重要作用，在青春期及成年早期，若突觸連接減少或者突觸被過度修剪，可以產(chǎn)生精神分裂癥的癥狀，因此推測Rein表達下降與精神分裂癥的認知功能下降和其他臨床癥狀有緊密聯(lián)系［19，22］。此研究提示PAX6基因多態(tài)性變化可能會引起腦結構的改變，進而參與精神分裂癥的發(fā)生。

此次研究中兩組SNPs rs667773、rs3026354位點基因分布都符合H-W平衡定律，對比兩組的SNPs rs667773位點，其基因型及等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計學意義，但SNPs rs3026354位點的分布頻率比較差異有統(tǒng)計學意義，該研究結果表明在中國北方的漢族人群中，精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展可能和PAX6基因rs3026354位點多態(tài)性的變化有聯(lián)系。再次對比rs667773、rs3026354位點各個基因型PANSS量表評分結果，發(fā)現(xiàn)患者組SNPs rs667773位點的一般精神病理因子分、陽性癥狀分和陰性癥狀分比較差異均無統(tǒng)計學意義，患者組rs3026354位點的一般精神病理因子分和陽性癥狀分比較差異無統(tǒng)計學意義，但陰性癥狀分比較差異有統(tǒng)計學意義，主要是TT型高于CC型和CT型，這可能是PAX6基因rs3026354位點多態(tài)性造成精神分裂癥陰性癥狀易感的原因之一；也可以表明SNPs rs3026354基因型及基因頻率的分布可能和精神分裂癥之間存在一定聯(lián)系。然而現(xiàn)在國內外對此方面的研究及文獻匯報均較少，故需要進一步研究確認。

此次研究過程中還有一些局限性，未來還需在不同地區(qū)不同種族中加大樣本量進行重復研究對比，也可從PAX6基因其他的基因表達和功能性位點方面進行研究探索，以便驗證此結果。隨著精神分裂癥與PAX6基因位點多態(tài)性之間關系的逐漸闡明，相信PAX6基因位點多態(tài)性的改變可作為評估精神分裂癥患者癥狀改善程度一項新的參考指標，為精神分裂癥的診療及預后評估指明一個新的方向。