海藻糖酶應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究

叢澤峰，彭超*，張宇，王林，叢琦林，陳美君

(1.中糧生化能源(龍江)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161100；2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261042；3.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014)

在溫敏型谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中，需要消耗大量的葡糖糖供菌體生長(zhǎng)利用，發(fā)酵前期，糖的消耗用于菌體生長(zhǎng)；發(fā)酵中后期，糖的消耗用于合成谷氨酸[1]。發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵環(huán)境的不斷改變，谷氨酸菌體受環(huán)境變化影響逐步合成海藻糖[2]；海藻糖由2個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成，不含有游離的醛基，不易降解為還原性單糖，可通過海藻糖酶分解[3]。谷氨酸菌體不能消耗利用海藻糖，影響發(fā)酵后期代謝物的合成，增加了流加糖的消耗，并對(duì)提取工序谷氨酸等電結(jié)晶工藝造成一定影響。為了進(jìn)一步提高谷氨酸發(fā)酵的收率及降低味精的生產(chǎn)成本，通過進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵工藝優(yōu)化，在發(fā)酵后期27～28 h加入海藻糖酶，將海藻糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，供谷氨酸菌體二次利用。經(jīng)過工藝優(yōu)化，發(fā)酵后期添加海藻糖酶后，谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸17.6 g/L，比發(fā)酵工藝調(diào)整前產(chǎn)酸提高了0.6%左右，發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率提高了0.9%左右，溫敏型谷氨酸發(fā)酵的綜合水平均有所提高。

1 材料與方法[4-6]

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

溫敏型谷氨酸菌種、生產(chǎn)用玉米漿、豆粕水解液、谷氨酸菌體蛋白：均由中糧生化能源(龍江)有限公司提供；谷氨酸菌體蛋白水解液：自制；甜菜糖蜜：北方制糖廠；聚醚消泡劑：濟(jì)南易豐化工廠；海藻糖酶：杰能科(中國)生物工程有限公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑：均購于天津科密歐有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器及設(shè)備

谷氨酸種子罐、谷氨酸發(fā)酵罐 國強(qiáng)生化公司；生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所；pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、722S型分光光度計(jì)。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，生產(chǎn)用玉米漿30 mL/L，尿素 5.0 g/L，酵母浸膏3.0 g/L，磷酸氫二鉀1.7 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳1 mg/L，硫酸亞鐵1 mg/L，維生素B1100 μg/L，維生素H 120 μg/L，pH 7.0，0.1 MPa，滅菌20 min。二級(jí)種子培養(yǎng)基：淀粉糖29 g/L，玉米漿20 mL/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂 0.6 g/L，硫酸錳0.2 mg/L，硫酸亞鐵0.2 mg/L，維生素B1200 μg/L，維生素H 120 μg/L，pH 7.0，滅菌20 min。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉水解糖50 g/L，玉米漿20 mL/L，豆粕水解液22 g/L，糖蜜45 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，硫酸錳35 mg/L，硫酸亞鐵20 mg/L，維生素B1300 μg/L，維生素H 400 μg/L，聚醚消泡劑1 mL/L，補(bǔ)料糖濃度為55%，分別采用1，2，3 mg/L，pH 7.0，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌體蛋白水解液

燒杯內(nèi)裝1.2 kg谷氨酸菌體蛋白，加入1.0 L濃硫酸，恒溫水浴鍋內(nèi)116 ℃維持15 h，終了取抽濾液。

1.4.2 搖瓶種子培養(yǎng)

試劑瓶?jī)?nèi)裝有一定量的種子培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后接入活化菌液，置搖床震蕩培養(yǎng)14 h，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，置于冰箱內(nèi)保藏。

1.4.3 種子罐培養(yǎng)

種子罐內(nèi)裝入一定量的培養(yǎng)液，經(jīng)滅菌后接入搖瓶種子進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)16 h左右，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，置于冰箱內(nèi)保藏。

1.4.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵罐內(nèi)裝入一定量的發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)滅菌后接入種子罐內(nèi)的種子進(jìn)行培養(yǎng)，33 ℃，通氣量90 mL/min，200 r/min；OD值為1.0時(shí)，溫度提高到38 ℃，轉(zhuǎn)速提高到800 r/min；殘?zhí)窃?%左右時(shí)流加糖液。控制pH在7.1左右，發(fā)酵培養(yǎng)40 h左右。發(fā)酵終了測(cè)定谷氨酸含量、總用糖量，核算糖酸轉(zhuǎn)化率(本文簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)化率)。

1.4.5 分析方法

OD值的測(cè)定：將發(fā)酵樣品稀釋，用722S分光光度計(jì)測(cè)定吸光值；pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)測(cè)定；還原糖和酸濃度的測(cè)定：采用生物傳感分析儀測(cè)定。發(fā)酵過程中，間隔2 h取一次樣，測(cè)定還原糖和酸濃度。

谷氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算[7]：

糖酸轉(zhuǎn)化率=(酸含量×發(fā)酵液體積)/(底糖濃度×發(fā)酵初體積+流加糖濃度×流加糖體積)×100%。

1.4.6 實(shí)驗(yàn)方法

在溫敏型谷氨酸發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵機(jī)理間歇添加不同量的海藻糖酶。通過對(duì)比谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率、轉(zhuǎn)化率、殘?zhí)羌癘D值綜合分析發(fā)酵結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方案1：原發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)方案2：添加不同量的海藻糖酶進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵周期添加海藻糖酶對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

溫敏型谷氨酸發(fā)酵過程中由于發(fā)酵環(huán)境的不斷改變，菌體受pH值、溫度、壓力等環(huán)境變化影響不斷代謝積累海藻糖，經(jīng)過多批次實(shí)驗(yàn)后，選用發(fā)酵周期27～28 h時(shí)間段添加海藻糖酶可以有效提高發(fā)酵產(chǎn)酸，結(jié)果見圖1。

圖1 不同發(fā)酵周期添加海藻糖酶對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.1 The effect of trehalase on the acid yield in different fermentation periods

溫敏型谷氨酸發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵環(huán)境的不斷改變，谷氨酸菌體受環(huán)境變化影響逐步代謝積累合成海藻糖。發(fā)酵后期，谷氨酸菌種活力逐步衰退，產(chǎn)酸能力逐漸減弱，隨著海藻糖的增多，反饋抑制影響發(fā)酵產(chǎn)酸水平。通過工藝優(yōu)化，發(fā)酵后期采用添加海藻糖酶有效酶解發(fā)酵液中的海藻糖，有利于進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)酸。由圖1可知，在發(fā)酵后期，2組發(fā)酵產(chǎn)酸接近，27～28 h添加海藻糖酶后，加酶組的發(fā)酵產(chǎn)酸明顯高于不加酶組0.6%左右。

2.2 海藻糖酶添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

將海藻糖酶采用1，2，3 mg/L 3種添加量分別添加到發(fā)酵液中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 添加不同量海藻糖酶發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果Table 1 The acid production results by adding different amount of trehalase

溫敏型谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)過程中，添加不同量的海藻糖酶對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸有很大的影響，通過添加不同量的海藻糖酶進(jìn)行對(duì)比，按照1 mg/L的添加量發(fā)酵產(chǎn)酸較好，見圖2。

圖2 不同添加量海藻糖酶對(duì)產(chǎn)酸響Fig.2 The effect of different additive amount of trehalase on acid production

2.3 添加海藻糖酶對(duì)發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

溫敏型谷氨酸發(fā)酵后期，通過添加海藻糖酶將谷氨酸發(fā)酵代謝過程積累的海藻糖進(jìn)行酶解合成可被谷氨酸菌利用的單糖，替代了一部分需要流加的水解糖，發(fā)酵產(chǎn)酸進(jìn)一步提高的同時(shí)，發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率也隨之提高，見圖3。

圖3 添加海藻糖酶對(duì)發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The effect of adding trehalase on the sugar-acid conversion rate

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溫敏型谷氨酸菌種在發(fā)酵過程中，發(fā)酵后期27～28 h添加海藻糖酶，發(fā)酵產(chǎn)酸提高0.6%左右，發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率可以提高0.9%左右，采用添加海藻糖酶的方法對(duì)溫敏型谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)起到促進(jìn)作用。