鎘致大鼠急性肝腎損傷與鋅內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)系

王海燕，覃 明，王克躍

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室貴州省研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099)

鎘(Cadium，Cd)是一種重金屬污染物，被國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)確認(rèn)為肺癌和前列腺癌的致癌物[1]，亦具有強(qiáng)大的誘癌能力，可造成人和動(dòng)物多器官或系統(tǒng)的毒性損傷。Cd被廣泛應(yīng)用于電鍍、電池、顏料及某些電子產(chǎn)品等工業(yè)生產(chǎn)中，目前，鎘元素已普遍存在于大氣、水體和土壤中[2]。人群Cd污染可通過(guò)職業(yè)暴露、空氣吸入[3]、食物[4]、水及皮膚接觸等多種途徑進(jìn)入人體。研究證實(shí)慢性鎘中毒時(shí)，攝入Cd的8%會(huì)經(jīng)胃腸吸收[5]。Cd進(jìn)入機(jī)體可通過(guò)生物放大和蓄積，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)半衰期長(zhǎng)達(dá)7～35年[6]，Cd經(jīng)吸收后主要與金屬硫蛋白(MT)結(jié)合形成Cd-MT復(fù)合物，對(duì)腎、肝、肺、骨、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生一系列損傷[7-10]。肝臟和腎臟是Cd中毒的主要靶器官，研究證實(shí)，急性Cd中毒可以增加脂肪肝和非酒精性肝炎的發(fā)生率[11]，對(duì)腎臟的損傷易形成腎小管功能障礙和不可逆的腎損傷[12]。我國(guó)的土壤和水中的Cd污染嚴(yán)重，大大增加了人群Cd中毒的風(fēng)險(xiǎn)，研究表明，日常Cd水平的攝入，就可能引起普通人群腎功能的損傷[13]。Cd的毒性作用機(jī)理與脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)，還可直接作用于靶部位，甚至影響體內(nèi)必需元素的正常代謝進(jìn)而影響其所介導(dǎo)的功能，例如Cd可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的替換Ca2+、Fe2+、Zn2+等金屬離子在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，改變膜的通透性而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[14]。

鋅(Zinc，Zn)是人體必需的微量元素，亦是機(jī)體內(nèi)幾百種酶的重要組成部分,它能穩(wěn)定細(xì)胞膜，也是維持自由基平衡的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)的組成成分。Zn與金屬蛋白的復(fù)合物能清除氧自由基，其本身也有抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用[15]，Zn還能穩(wěn)定溶酶體、線粒體、微粒體的膜結(jié)構(gòu)，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化有阻抑作用[16]。Zn與Cd是同族(ⅡB)相鄰元素，理化性質(zhì)相似，在吸收、分布和排泄的不同階段均存在不同程度的相互影響。近年來(lái)研究表明，Zn對(duì)Cd所致大鼠含鋅酶活性降低有保護(hù)作用[17]，Cd能影響前列腺PC3細(xì)胞膜中上的ZnT1mRNA的表達(dá)[18]，體外試驗(yàn)也表明Cd對(duì)某些鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體有影響[18]。本研究旨在利用整體動(dòng)物通過(guò)預(yù)補(bǔ)Zn，分析預(yù)補(bǔ)Zn對(duì)Cd引起的肝腎損傷的作用及Zn內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 氯化鎘(AR，上海試劑二廠)，硫酸鋅(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，巰基乙醇(Bio Basic INC，mercaptoethanol，ME)，水中鎘、鋅標(biāo)準(zhǔn)物(上海市計(jì)量測(cè)試研究所)，尿肌酐試劑盒(榮盛生物公司)，尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)活性測(cè)定試劑盒(上海太陽(yáng)生物公司)，β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)放射免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究生所)，微量丙二醛(MDA，malonaldehyde)、總抗氧化能力(T-AOC，Total Anti-oxygen Capacity)、超氧化物歧化酶(SOD，superoxide dismutase)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT，glutamic phyuvic transaminase)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、白蛋白(ALB，albumin，)和總蛋白(TP，total protein)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

原子吸收光譜儀(PE公司，美國(guó))，GC-2010型自動(dòng)放免儀(中國(guó)科大中佳公司)，HITACHI7170A生化分析儀(日本日立公司)，荷蘭飛利浦TECNAI10-透射電鏡、AU2700全自動(dòng)生化分析儀(日本OLYMPUS公司)，大鼠代謝籠(江蘇省蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用玻璃儀器均需要泡酸處理12 h以上。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 清潔級(jí)SD大鼠32只，體重(252.4±20.2)g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、補(bǔ)鋅組、染鎘組和補(bǔ)鋅+染鎘組。所有補(bǔ)鋅組均飲用含300 mg(Zn2+)/L的去離子水(由硫酸鋅配制)，其他組飲用不含鋅的去離子水，飼養(yǎng)14 d后，空白對(duì)照和單獨(dú)補(bǔ)鋅組腹腔注射生理鹽水，所有染鎘組一次性給予腹腔注射CdCl2(15 μmol/kg)+ME(300 μmol/kg)混和液，使Cd2+的濃度為2 mg/kg體重，建立急性鎘肝腎中毒模型。

1.3 樣品收集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 尿樣大鼠染鎘后置于代謝籠中，在冰浴下收集前12 h和后12 h尿液，尿樣于-80 ℃保存待測(cè)，補(bǔ)鋅組及對(duì)照組采用同樣方法處理。尿鎘采用無(wú)焰原子吸收法測(cè)定；尿β2-MG用放射免疫法測(cè)定；尿NAG的活性用對(duì)-硝基苯酚比色法測(cè)定；尿肌酐(UCr，urinary creatinine，)用苦味酸法測(cè)定；尿TP用溴甲酚綠法測(cè)定；ALB用WeichseLbaum修改法；按試劑盒說(shuō)明提供的方法操作。

1.3.2 全血和血清 收集尿液24 h，戊巴比妥納(1%)腹腔注射麻醉(40 mg/kg)大鼠，斷頭處死，采用自制的肝素鈉EP管收集全血約1 mL，其余血液分離血清，于-80 ℃保存待測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。血清中AKP活性及血清鋅的測(cè)定采用全自動(dòng)生化分析儀。血液采用硝化法硝化后用無(wú)焰原子吸收法測(cè)定鎘離子的濃度。

1.3.3 肝腎組織 大鼠斷頭處死后，75%酒精腹部消毒，快速切取約1 mm3的肝腎組織塊放入2.5%戊二醛中固定，4 ℃保存；切取厚度約2 mm3的肝腎組織放入10%甲醛固定液中固定，4 ℃保存；取肝組織約0.5 g，腎皮質(zhì)約0.2 g，并準(zhǔn)確記錄重量，-80 ℃保存，用于制作組織勻漿測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。

取已稱重肝腎組織，采用硝化法硝化，然后用無(wú)焰原子吸收法測(cè)定鎘、鋅離子濃度。制備組織勻漿測(cè)定肝組織中MDA的含量、SOD活性、AKP活性和腎臟中T-AOC的活性。肝腎組織中蛋白測(cè)定分別用考馬斯亮藍(lán)法和雙縮脲法。

2 結(jié)果

2.1 血清及肝腎組織中鋅含量測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)鋅組肝腎組織中鋅含量明顯升高；染鎘組肝腎組織鋅含量升高，而血清鋅降低；補(bǔ)鋅+染鎘組肝腎組織鋅含量升高，血清鋅降低。與染鎘組比較，補(bǔ)鋅+染鎘組血清鋅升高，肝鋅和腎鋅升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，見表1)。

分組血清鋅(μg/L)肝鋅(μg/g)腎鋅(μg/g)空白對(duì)照30.28±8.7439.58±4.1334.76±3.84補(bǔ)鋅31.63±6.8452.46±9.37a43.60±3.40a染鎘9.50±2.58ab47.98±3.88a40.46±2.42a補(bǔ)鋅+染鎘20.40±4.47abc61.24±5.52ac53.78±2.53ac

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與補(bǔ)鋅組比較，P<0.05；c：與染鎘組比較，P<0.05。

2.2 尿、血液及肝腎組織中鎘含量測(cè)定結(jié)果 染鎘組的尿、血及肝腎組織中鎘含量較空白對(duì)照組和補(bǔ)鋅組明顯升高；預(yù)先補(bǔ)鋅后，尿及肝腎組織中的鎘含量明顯升高，血液中的鎘含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

分組尿鎘[μg/g(Cr)]血鎘(μg/L)腎鎘(μg/g)肝鎘(μg/g)空白對(duì)照73.31±8.000.41±0.130.43±0.110.51±0.23補(bǔ)鋅75.78±6.440.37±0.190.65±0.120.75±0.11染鎘 912.39±128.74ab6.17±1.07ab127.02±21.17ab774.38±155.10ab

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與補(bǔ)鋅組比較，P<0.05；c：與染鎘組比較，P<0.05。

2.3 尿NAG的活性及尿β2-MG、尿TP和尿ALB的含量測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，染鎘組尿β2-MG、尿TP和尿ALB的含量升高，尿NAG活性上升；補(bǔ)鋅染鎘后，與染鎘組比較，尿β2-MG、尿TP和尿ALB的含量較染鎘組下降，尿NAG活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

分組尿NAG[U/g(Cr)]尿TP(g/L)尿ALB(g/L)尿β2-MG[Ug/g(Cr)]空白對(duì)照160.86±60.6214.42±3.432.64±0.782.85±1.15補(bǔ)鋅175.54±30.3514.45±5.172.36±0.921.94±1.08染鎘2326.88±968.54ab 208.09±42.90ab 70.76±11.61ab 7.85±3.37ab補(bǔ)鋅+染鎘1312.45±435.74abc 118.97±32.37abc 41.06±7.89abc 3.43±1.25abc

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與補(bǔ)鋅組比較，P<0.05；c：與染鎘組比較，P<0.05。

2.4 腎臟中T-AOC、SOD活性及MDA含量測(cè)定 與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)鋅組T-AOC的活性升高，染鎘組腎SOD、T-AOC的活性下降，MDA含量上升；與染鎘組比較，補(bǔ)鋅染鎘組腎SOD、T-AOC的活性較染鎘組回升，MDA的含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

分組T-AOC[單位/mg(prot)]MDA[nmol/mg(prot)]SOD[U/mg(prot)]空白對(duì)照11.56±2.841.29±0.1727.19±4.71補(bǔ)鋅13.82±5.14a1.28±0.2527.91±3.97染鎘6.99±1.52ab2.68±0.48ab16.89±1.82ab補(bǔ)鋅+染鎘10.16±1.88c1.57±0.14c26.45±4.10c

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與補(bǔ)鋅組比較，P<0.05；c：與染鎘組比較，P<0.05。

2.5 血清中GPT和AKP的活性測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，染鎘組血清AKP活性下降，而血清GPT的活性升高；與染鎘組比較，補(bǔ)鋅染鎘組的AKP和GPT的改變剛好相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表5)。

2.6 肝臟中MDA含量及SOD、AKP活性測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，染鎘組SOD、AKP的活性下降，MDA含量升高；與染鎘組相比，補(bǔ)鋅染鎘組SOD、AKP及MDA的改變剛好相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表6)。

分組血清GPT(U/L)血清AKP(U/L)空白對(duì)照63.50±9.61 140.75±26.16補(bǔ)鋅57.38±17.01145.75±31.84染鎘142.75±23.96ab80.75±11.83ab補(bǔ)鋅+染鎘97.25±23.38abc92.63±21.74ab

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與補(bǔ)鋅組比較，P<0.05；c：與染鎘組比較，P<0.05。

分組MDA[nmol/mg(prot)]SOD[U/mg(prot)]AKP[U/g(prot)]空白對(duì)照0.34±0.0714.62±2.230.55±0.16補(bǔ)鋅0.28±0.0715.39±3.490.79±0.21染鎘0.54±0.06ab9.68±2.13ab0.22±0.11ab補(bǔ)鋅+染鎘0.42±0.06abc13.41±2.93c0.38±0.08abc

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與補(bǔ)鋅組比較，P<0.05；c：與染鎘組比較，P<0.05。

2.7 大鼠體內(nèi)鎘含量與鋅離子的分布及與反映腎損傷指標(biāo)之間的相關(guān)性 血清鋅與血鎘、尿NAG的活性、尿β2-MG 、尿ALB及尿TP的含量負(fù)相關(guān)；腎鋅與SOD、T-AOC、血清AKP正相關(guān)，與MDA負(fù)相關(guān)(見表7)。

表7鋅分布與腎臟損傷指標(biāo)及脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)間的相關(guān)分析

變量尿β2-MG尿TP尿ALB尿NAG血CdSODMDA血AKPT-AOC腎Zn-0.030.210.110.300.160.70*-0.74*0.62*0.66*血清Zn-0.77*-0.79*-0.77*-0.73*-0.77*----

*：P<0.01。

2.8 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.8.1 光鏡檢查結(jié)果 空白對(duì)照組和補(bǔ)鋅組腎組織未見異常改變，腎小球、腎小管完好(見圖1A，1B)；染鎘組腎小管上皮細(xì)胞明顯壞死、變性，呈萎縮彌漫性壞死，壞死組織中可見棕黃色金屬?gòu)?fù)合物晶體沉淀，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)看不到(見圖1C)；補(bǔ)鋅染鎘組腎皮質(zhì)細(xì)胞輕微的變性，未見壞死，可見結(jié)構(gòu)基本正常的腎小球組織(見圖1D)。

A：空白對(duì)照組；B：補(bǔ)鋅組；C：染鎘組；D：補(bǔ)鋅染鎘組。圖1 腎臟組織HE染色結(jié)果(×400)

2.8.2 腎臟組織透射電鏡觀察結(jié)果 空白對(duì)照組和補(bǔ)鋅組的腎組織均未見差異，腎小球規(guī)則、完整，微絨毛規(guī)則整齊，細(xì)胞核完整(見圖2A，2B，3A，3B)；染鎘組的線粒體腫脹，嵴紊亂模糊，脂肪變性明顯，微粒體擴(kuò)張明顯、紊亂、層次不清(見圖2C，3C)；與單獨(dú)染鎘組比較，補(bǔ)鋅染鎘組的線粒體腫脹、脊紊亂、脂肪變性的程度較輕微，微絨毛和微粒體較規(guī)則(見圖2D，3D)。

A：空白對(duì)照組；B：補(bǔ)鋅組；C：染鎘組；D：染鎘補(bǔ)鋅組。圖2 腎臟組織電鏡觀察(×3 700)

A：空白對(duì)照組；B：補(bǔ)鋅組；C：染鎘組；D：補(bǔ)鋅染鎘組。圖3 腎臟組織電鏡觀察結(jié)果(×12 500)

3 討論

結(jié)果顯示染鎘組大鼠尿中NAG的活性明顯降低，尿β2-MG和尿TP的含量升高，病理改變顯示染鎘后導(dǎo)致明顯腎小管損傷，引起了大鼠的急性腎損傷，表明鎘腎損傷模型建立成功。染鎘組光鏡下觀察到腎小管上皮細(xì)胞明顯壞死，看不到細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，而預(yù)補(bǔ)鋅后染鎘雖可觀察到腎小管上皮細(xì)胞壞死，但正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可見，損傷較輕微，說(shuō)明鎘的急性損傷以腎小管上皮細(xì)胞損傷為主要靶器官。電鏡下觀察染鎘后線粒體腫脹，嵴紊亂模糊，脂肪變性明顯，微粒體擴(kuò)張明顯，層次不清楚，微絨毛紊亂等，而預(yù)補(bǔ)鋅后染鎘微絨毛和微粒體較規(guī)則，線粒體的腫脹、脊紊亂、脂肪變性的程度有所改善，肝組織的形態(tài)學(xué)結(jié)果也觀察到同樣的改變(圖略)。以上形態(tài)學(xué)的觀察提示預(yù)補(bǔ)鋅對(duì)肝鎘引起的腎損傷有一定的拮抗作用，染鎘組腎臟中T-AOC、SOD的活性和肝臟中AKP、SOD的活性均下降，肝腎中MDA含量升高，肝臟中Zn含量升高，腎臟中Zn含量也呈上升趨勢(shì)，而血清中Zn降低；且血清鋅與血鎘、尿NAG的活性、尿β2-MG、尿ALB及尿TP的含量負(fù)相關(guān)，腎鋅與SOD、T-AOC、血清AKP正相關(guān)，與MDA負(fù)相關(guān)，提示鎘引起的這種損傷與脂質(zhì)過(guò)氧化、抗氧化能力下降和鋅內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變有關(guān)。大鼠染鎘后，染鎘組肝腎組織中Zn含量呈上升趨勢(shì)，而血清中Zn含量降低，考慮是染鎘后機(jī)體將血液中Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟和腎臟中，從而改變了鋅2+的分布。生理狀態(tài)下，鋅金屬巰蛋白(Zn-MT)是體內(nèi)Zn的儲(chǔ)存庫(kù)，是可利用的Zn供體[19]，Cd被機(jī)體吸收以后與MT結(jié)合的能力大于Zn2+，染Cd組，Cd進(jìn)入細(xì)胞后將Zn-MT中的Zn置換出來(lái)形成Cd金屬巰蛋白(Cd-MT)，Zn由線粒體、胞槳向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移[20]，Cd將Zn-MT中的鋅離子置換出來(lái)，使細(xì)胞內(nèi)可利用的鋅含量減少，作為一種保護(hù)機(jī)制，機(jī)體將血清中的Zn向肝臟轉(zhuǎn)移，作為一種代償機(jī)制，鋅的這種改變有利于鎘毒性產(chǎn)生結(jié)抗。預(yù)補(bǔ)鋅后再染鎘，尿中NAG的活性明顯升高，β2-MG和尿TP的含量降低，同時(shí)肝臟中AKP、SOD的活性和腎臟中T-AOC、SOD的活性均上升，肝腎中MDA的含量降低，表明預(yù)補(bǔ)鋅后，減緩了肝腎組織的過(guò)氧化程度，對(duì)鎘引起的肝腎毒性有保護(hù)作用，與之前的研究結(jié)果相同。

綜上所述，急性鎘染毒引起肝腎臟損傷，預(yù)補(bǔ)鋅能拮抗鎘引起的肝腎毒性，該損傷與體內(nèi)鋅離子分布狀態(tài)的改變有關(guān)。這一研究結(jié)果亦提示我們進(jìn)一步探討鎘急性毒性與鋅離子及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的關(guān)系具有重要意義。