miR-3077-5P對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化能力的影響

楊曉紅，楊 琨，廖 立，金 巖

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復(fù)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099；3.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 組織工程研究中心，陜西 西安 710032)

微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)高度保守的、廣泛存在于細(xì)胞中的單鏈、非編碼小 RNA，一般含有 22～24個(gè)核苷酸[1]。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因 mRNA 的 3' 非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)互補(bǔ)結(jié)合抑制基因表達(dá)[2]，是基因表達(dá)的重要調(diào)控手段，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。最新研究表明，miRNA廣泛參與了干細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、代謝等過(guò)程的調(diào)控，在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-27a、miR-130、miR-378和miR-138在干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[5]。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)中的miR-3077-5P異常升高[6]，證實(shí)了miR-3077-5P參與了BMMSC成脂分化能力的調(diào)控。近年來(lái)有學(xué)者報(bào)道，通過(guò)體內(nèi)調(diào)控干細(xì)胞miRNA的表達(dá)，可以有效的提高病理狀態(tài)下組織損傷的修復(fù)能力，直接治療疾病[7]，這些開(kāi)拓性研究提示miRNA可以作為治療疾病新靶點(diǎn)思路，假設(shè)miR-3077-5P對(duì)脂肪前體細(xì)胞成脂分化調(diào)控具有相似的調(diào)控功能，這為miR-3077-5P作為新靶點(diǎn)藥物治療的研發(fā)和治療脂肪分化異常引起的疾病(如骨質(zhì)疏松、肥胖)提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)3T3-L1前脂肪細(xì)胞中miR-3077-5P，檢測(cè)過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)miR-3077-5P對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞在成脂分化誘導(dǎo)過(guò)程中成脂能力的差異，從而探討miR-3077-5P對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂分化過(guò)程的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；油紅O購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站；IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beyotime公司；miR-3077-5P control、miR-3077-5P mimics、miR-3077-5P inhibitor和內(nèi)參U6購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；siPORTTMNeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；β-actin鼠單克隆抗體、抗小鼠過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)、三羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam有限公司; LPL和PPAR-γ 引物 (TaKaRa，日本)。

1.2 主要儀器設(shè)備 Real time定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-tek，美國(guó))；凝膠成像分析系統(tǒng)(天能，上海)；電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及miR-3077-5P轉(zhuǎn)染 以1×104個(gè)/cm2密度接種3T3-L1細(xì)胞，用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液一次，待細(xì)胞融合90%，用0.25%胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

于轉(zhuǎn)染前一天將3T3-L1前脂肪細(xì)胞更換為無(wú)血清的培養(yǎng)液，用無(wú)雙抗的培養(yǎng)液將細(xì)胞消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后置37 ℃孵育備用。細(xì)胞分為3組，分別為control組、mimics組及inhibitor組。轉(zhuǎn)染時(shí)先稀釋siPORTTMNeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑(24孔板用量)，每孔用量為20 μL培養(yǎng)液(無(wú)血清無(wú)雙抗)+5 μL轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置10 min；再稀釋需要轉(zhuǎn)染miRNA：miRNA 1.5 μL(10 μmol/L)+ 20 μL培養(yǎng)基(無(wú)血清無(wú)雙抗)，室溫靜置10 min。將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑和miRNA輕輕混勻，室溫靜置10 min后移至24 孔板。將制備好的細(xì)胞懸液以每孔450 μL(4×104)接種于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)孔中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑充分接觸。置37℃孵箱培養(yǎng)，12 h更換完全培養(yǎng)基，72 h后收集細(xì)胞，行轉(zhuǎn)染成功與否鑒定。其方法是用總RNA提取試劑盒，一步法提取細(xì)胞總RNA，并按照Bulge-Loop miRNA 實(shí)時(shí)qRT-PCR Primer(廣州市銳博生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上述3T3-L1前脂肪細(xì)胞中miR-3077-5P的表達(dá)量，miR-3077-5P的引物序列均由廣州銳博生物有限公司合成：miR-3077-5P(Product ID:miRQ0003495-1-2)和 U6(Product ID:MQP-0202)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 油紅O染色檢測(cè)脂滴形成及定量分析 將轉(zhuǎn)染了miR-3077-5P mimics、miR-3077-5P inhibitor、miR-3077-5P control的3T3-L1前脂肪細(xì)胞加入成脂誘導(dǎo)液(10%FBS 的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.01μM 地塞米松,0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，60 μM吲哚美辛，2 mM胰島素)誘導(dǎo)培養(yǎng)10d后，用油紅O對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色觀察脂滴形成；將異丙醇加入已染上色的油小滴樣本中10 min，收集溶解液，酶標(biāo)儀檢測(cè)溶解液的OD值(波長(zhǎng)520 mm)，進(jìn)行定量分析。

1.5 RT-PCR檢測(cè)PPAR-γ、LPL mRNA表達(dá) 3組3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后進(jìn)行細(xì)胞收集，按TRIzol說(shuō)明書(shū)抽提各組細(xì)胞總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，以Primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物；以β-actin為內(nèi)參照，采用RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各0.5 μL、樣本模板2 μL；其定量計(jì)算方法：RNA樣品的濃度(ng/μL)=RNAOD值×稀釋倍數(shù)×40;反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min ,94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s ,40個(gè)循環(huán)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所用引物均由TaKaRa公司合成，各引物基因序列見(jiàn)表1。

表1引物基因序列

基因引物序列PPAR-γF-ACTGCCGGATCCACAAAAR-TCTCCTTCTCGGCCTGTGLPLF-CCCCAGTCGCCTTTCTCCTGATR-CTCTTGGCTCTGACCTTGTTGATβ-actinF-CTGGCACCACACCTTCTACAR-GGTACGACCAGAGGCATACA

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PPAR-γ及FABP4蛋白表達(dá) 取成脂誘導(dǎo)10 d后的各組細(xì)胞，用碧云天Western及IP細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提?。粐?yán)格按照BCA蛋白定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行蛋白定量測(cè)定；加入蛋白樣品20～30 μL后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳:80V40 min，120V90 min(電泳緩沖液液配置：H2O 1L；Tris 3.03 g；甘氨酸14.4 g；SDS 1g)；采用硝酸纖維素膜，200 mA轉(zhuǎn)膜90 min；10%小牛血清白蛋白37 ℃封閉2 h，封閉β-actin(稀釋度1∶10 000)和 PPAR-γ、FABP4(稀釋度1∶10 00)的抗體并4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜液清洗10 min，3次；加入三羊抗小鼠IgG(稀釋度1∶50 000)，室溫孵育2 h；最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)各組PPAR-γ和FABP4蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染miR-3077-5P miR-3077-5P mimics組、control組和inhibitor組miR-3077-5P的表達(dá)水平分別為40.90±0.03、1.00±0.04和0.18±0.02，轉(zhuǎn)染72 h后，mimics組中miR-3077-5P的表達(dá)量較control組上調(diào)約48倍，inhibitor組中miR-3077-5P的表達(dá)量較對(duì)照物組下調(diào)了69%(見(jiàn)圖1)。提示通過(guò)轉(zhuǎn)染特異性mimics或inhibitor能有效調(diào)控3T3-L1前脂肪細(xì)胞中miR-3077-5P的表達(dá)水平，并且在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

*：vs control，P<0.05；**：vs control，P<0.01；n=3。圖1 化學(xué)合成miR-3077-5P mimics和inhibitor對(duì)miR-3077-5P表達(dá)水平的影響

2.2 3組3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂滴形成及定量分析 鏡下可見(jiàn)細(xì)胞由誘導(dǎo)前梭形變?yōu)闄E圓形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)一至數(shù)個(gè)大小不等、折光性強(qiáng)、圓形透亮脂肪滴，脂滴呈串珠狀排列、細(xì)胞核被脂滴擠壓于細(xì)胞一側(cè)。與control組比較，mimics組油紅染色較深，胞漿內(nèi)脂滴體積較大、脂滴數(shù)目較多，inhibitor組著色細(xì)胞數(shù)量極少，細(xì)胞胞漿染色較淺及胞漿脂滴小而少(見(jiàn)圖2)，油紅O定量顯示mimics組所形成的脂滴數(shù)量明顯高于inhibitor組，兩組間有顯著差異性(P<0.001)(見(jiàn)圖3)。脂滴染色及定量檢測(cè)表明 mimics組細(xì)胞成脂能力較強(qiáng)。

Control mimics inhibitor圖2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)10 d油紅O染色

***：vs control，P<0.001 ；n=3。圖3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)10 d油紅O染色脂滴定量檢測(cè)

2.3 3組3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂基因 PPAR-γ、LPL mRNA表達(dá)比較 與control組比較，mimics組PPAR-γ成脂基因的mRNA表達(dá)量明顯升高，而inhibitor組其表達(dá)水平明顯降低，3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)(見(jiàn)圖4A)。3組細(xì)胞中LPL成脂基因的mRNA表達(dá)與PPAR-γ結(jié)果相似，其在mimics組表達(dá)量最高，3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)(見(jiàn)圖4B)，以上基因檢測(cè)表明miR-3077-5P表達(dá)量升高時(shí)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂能力較強(qiáng)，這提示miR-3077-5P對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)過(guò)程具有促進(jìn)作用。

A：PPAR-γ的mRNA水平；B:LPL 的mRNA 水平。 ***：vs control，P < 0.001 ；n=3。圖4 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)10 d成脂基因PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平

2.4 3組3T3-L1前脂肪細(xì)胞PPAR-γ和FABP4蛋白表達(dá)比較 mimics組PPAR-γ和FABP4蛋白水平顯著高于inhibitor組，3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(見(jiàn)圖5)，進(jìn)一步證實(shí)了在3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)過(guò)程中miR-3077-5P對(duì)其具有促進(jìn)作用。

圖5 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)10 d后PPAR-γ和FABP4的蛋白表達(dá)水平

3 討論

干細(xì)胞具有多向分化能力，當(dāng)成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞胞漿內(nèi)有脂滴形成和高表達(dá)PPAR-γ、LPL、FABP4等調(diào)節(jié)脂肪形成的相關(guān)蛋白。其中脂滴的形成是脂肪細(xì)胞的特征表現(xiàn)[8]，細(xì)胞內(nèi)脂滴體積的大小和數(shù)量多少是細(xì)胞成脂分化能力大小及成熟度的量化指標(biāo)[9,14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)油紅0染色和定量分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-3077-5P mimcs和miR-3077-5P inhibitor的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)成脂誘導(dǎo)10 d，其mimics 組比inhibitor組細(xì)胞胞漿內(nèi)著色深、脂滴數(shù)目多、脂滴較大。這表明兩組細(xì)胞都已經(jīng)向成脂方向分化為脂肪細(xì)胞，且mimics組成脂分化能力較強(qiáng)。

PPAR-γ是核受體超家族成員之一，是調(diào)控干細(xì)胞向成脂細(xì)胞分化過(guò)程中的一種特異性轉(zhuǎn)錄因子[9]，對(duì)LPL、FABP4成脂基因都具有重要的調(diào)控作用，因此是成脂分化過(guò)程的中心調(diào)控因子[11]。它在脂肪細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控脂肪細(xì)胞分化速度和脂滴的形成，是成脂的標(biāo)志性基因[12]。LPL和FABP4是反映成脂分化能力的關(guān)鍵指標(biāo)[13]，F(xiàn)ABP4又是成熟脂肪細(xì)胞胞質(zhì)的重要蛋白[14-15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示， mimcs組的3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞中PPAR-γ和LPL的表達(dá)量較對(duì)照組和ihibitor組高。這表明mimcs組的3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化能力最高及3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂能力大小與miR-3077-5P在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量密切相關(guān)，miR-3077-5P在3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量越高，其成脂能力越強(qiáng)。提示miR-3077-5P在基因水平上對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化起著促進(jìn)作用。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-3077-5P對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化具有促進(jìn)作用，同時(shí)我們從蛋白水平上檢測(cè)了各組細(xì)胞中的成脂關(guān)鍵基因PPAR-γ和FABP4的表達(dá)量，結(jié)果顯示，PPAR-γ和FABP4的蛋白表達(dá)結(jié)果與PPAR-γ 和LPL 的mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。以上結(jié)果從基因水平和蛋白水平均證明了miR-3077-5P在 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株成脂分化具有成脂分化的促進(jìn)功能作用。

綜上所述，雖然我們發(fā)現(xiàn)了miR-3077-5P在 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株成脂分化過(guò)程中具有成脂分化的促進(jìn)用，但miR-3077-5P在翻譯后水平通過(guò)調(diào)控何種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮其作用待進(jìn)一步研究。同時(shí)我們對(duì)miR-3077-5P研究結(jié)果均是體外研究結(jié)果，其在體內(nèi)是否亦能夠通過(guò)miR-3077-5P介導(dǎo)進(jìn)行相關(guān)疾病機(jī)制及治療的研究是后續(xù)研究工作的重要內(nèi)容。