半乳糖凝集素1，3在妊娠期高血壓產(chǎn)婦胎盤中的表達(dá)及意義

胡麗芳，黃文珍,劉 彤

(武漢市第五醫(yī)院 產(chǎn)科， 湖北 武漢 430050)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是妊娠期婦女常見并發(fā)癥，是引起圍產(chǎn)期母嬰死亡的主要原因之一[1]。對(duì)于HDCP的救治已成為廣大婦產(chǎn)科醫(yī)師亟待解決的棘手問題，探討其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。半乳糖凝集素家族屬于糖結(jié)合蛋白的一種，通過與細(xì)胞表面的糖基化蛋白或者細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白特異性結(jié)合發(fā)揮功能，具有廣泛的生物活性，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化，抑制中性粒細(xì)胞滲出，降低宿主對(duì)同種異體物的免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受[2-3]。半乳糖凝集素-1(galectin-1，Gal-1)和半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)被證明參與了妊娠期糖尿病、子癇前期、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等多種妊娠期疾病的發(fā)病[4-5]。本研究以我院收治的70例HDCP產(chǎn)婦為研究對(duì)象，探討產(chǎn)婦胎盤中Gal-1和Gal-3的表達(dá)及意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月到2017年6月我院收治的70例HDCP產(chǎn)婦作為觀察組，均符合康寧主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版有關(guān)妊娠期高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。70例HDCP產(chǎn)婦，年齡19～41歲，平均(26.4±5.7)歲；孕期27～40周，平均(36.5±2.9)周；妊娠期高血壓57例，子癇前期13例。排除原發(fā)性高血壓、糖尿病、高血脂、肝腎疾病以及多胎產(chǎn)婦。選取30例同期在我院體檢的正常產(chǎn)婦作為對(duì)照組，年齡20～41歲，平均(25.4±6.3)歲，孕期25～40周，平均(35.3±3.2)周。各組產(chǎn)婦的年齡、體重指數(shù)、孕周、初潮年齡、流產(chǎn)史、生育史等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有產(chǎn)婦均知情同意并簽署知情同意書，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1各組產(chǎn)婦的一般資料比較

組別例數(shù)年齡(歲)體重指數(shù)(kg/m2)孕周(周)初潮年齡(歲)流產(chǎn)史(次)生育史(次)觀察7026.4±5.7*25.9±4.3*36.5±2.9*11.3±1.5*1.4±0.3*1.4±0.4* 妊娠期高血壓5725.8±5.9*25.4±4.6*36.1±3.1*11.5±1.4*1.3±0.5*1.4±0.3* 子癇前期1326.7±6.1*#26.5±4.0*#36.9±2.5*#10.8±1.6*#1.5±0.3*#1.5±0.2*#對(duì)照3025.4±6.326.4±4.135.3±3.210.8±1.31.4±0.51.5±0.3

與對(duì)照組比較，*：P>0.05；與妊娠期高血壓比較，#：P>0.05。

1.2 治療方法 HDCP治療基本原則是休息、鎮(zhèn)靜、解痙，有指征的降壓、利尿，密切監(jiān)測(cè)母胎情況，適時(shí)終止妊娠。對(duì)于收縮壓≥140 mmHg 和(或) 舒張壓 ≥ 90 mmHg的患者酌情使用降壓藥，主要有拉貝洛爾、硝苯地平緩釋片；部分口服降壓不理想的患者可靜脈滴注拉貝洛爾、酚妥拉明。對(duì)于痙攣患者可使用硫酸鎂解痙。對(duì)于并發(fā)心衰、肺水腫、腦水腫、全身浮腫、腎功能不全的少尿無(wú)尿患者，酌情使用呋塞米、甘露醇利尿。

1.3 標(biāo)本采集 胎盤娩出后，取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm胎盤組織，注意避開鈣化和壞死區(qū)域，用無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈。一份胎盤組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，保存待檢；另一份胎盤組織剪碎后加入組織裂解液，勻漿、離心后取上清，-20 ℃保存待檢。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Gal-1和Gal-3表達(dá) 取出保存的胎盤組織石蠟切片，60 ℃烘箱烤片60 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，磷酸鹽洗液(PBS)淋洗，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBS淋洗，滴加兔抗人一抗(抗Gal-1，抗Gal-3，抗體滴度均為0.1 μg/mL，可按1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，PBS淋洗，滴加羊抗兔二抗(抗體滴度為0.5 μg/mL，可按1∶5 000稀釋)，室溫孵育30 min，PBS淋洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照以PBS作為一抗代替。參照文獻(xiàn)[7]，光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，以陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度兩方面進(jìn)行綜合評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例低于5%，計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞比例占5%～30%，計(jì)1分；陽(yáng)性細(xì)胞比例占31%～60%，計(jì)2分；陽(yáng)性細(xì)胞比例大于60%，計(jì)3分。棕色染色計(jì)3分，淺棕色染色計(jì)2分，淺黃色染色計(jì)1分，無(wú)染色計(jì)0分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘即為最終評(píng)分，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，6～9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 蛋白印跡法檢測(cè)Gal-1和Gal-3表達(dá) 取出保存的胎盤組織勻漿上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，取100 μg蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(PVDF)。TBST漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗人一抗(抗Gal-1，抗Gal-3)工作液(1∶500)，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室內(nèi)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、曝光。BioRad系統(tǒng)分析，目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)婦胎盤組織細(xì)胞中Gal-1和Gal-3陽(yáng)性比例比較 Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示：觀察組產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織中Gal-1和Gal-3表達(dá)明顯高于妊娠期高血壓產(chǎn)婦和對(duì)照組(P<0.05)，而妊娠期高血壓產(chǎn)婦胎盤組織中Gal-1和Gal-3表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)比較

組別例數(shù)Gal-1-++++++Gal-3-++++++觀察701181734972133 妊娠期高血壓571171524861924 子癇前期13012101129對(duì)照30127101106113

A：對(duì)照組胎盤組織Gal-1表達(dá)；B：妊娠期高血壓產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1表達(dá)；C：子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1表達(dá)；D：對(duì)照組胎盤組織Gal-3表達(dá)；E：妊娠期高血壓產(chǎn)婦胎盤組織Gal-3表達(dá)；F：子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織Gal-3表達(dá)。圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)(×400)

2.2 產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3蛋白表達(dá)量比較 子癇前期產(chǎn)婦、妊娠期高血壓產(chǎn)婦和對(duì)照組產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3蛋白水平比較存在顯著性差異(P<0.05)，其中子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3蛋白水平明顯高于妊娠期高血壓產(chǎn)婦和對(duì)照組產(chǎn)婦(P<0.05)，而妊娠期高血壓產(chǎn)婦又明顯高于對(duì)照組產(chǎn)婦(P<0.05)。

表3產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3蛋白表達(dá)比較

組別例數(shù)Gal-1Gal-3觀察700.52±0.13*0.57±0.13* 妊娠期高血壓570.37±0.09*0.44±0.11* 子癇前期131.21±0.17*#1.13±0.14*#對(duì)照300.11±0.050.18±0.06

與對(duì)照組比較，*:P<0.05；與妊娠期高血壓比較，#:P<0.05。

A：對(duì)照組；B：妊娠期高血壓；C：子癇前期。 圖2 蛋白印跡法檢測(cè)各組產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)

3 討論

目前有關(guān)HDCP的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，一般認(rèn)為與免疫調(diào)節(jié)功能異常和母胎免疫耐受失衡等眾多因素有關(guān)[8-10]。生殖免疫學(xué)認(rèn)為，正常妊娠是自然同種異體移植過程，母體需要容受部分由父親基因編碼的胚泡的植入，妊娠的成功有賴于胎兒與母體間免疫平衡的建立，當(dāng)母胎免疫耐受失衡時(shí)就有可能引起免疫排斥導(dǎo)致病理妊娠[11-12]。胎盤局部免疫排斥反應(yīng)異常，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和功能損傷，被認(rèn)為是引起HDCP的主要原因之一[13]。

半乳糖凝集素是一類能夠選擇性識(shí)別糖結(jié)構(gòu)并與之以非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，其家族分布廣泛，存在于多種組織和細(xì)胞內(nèi)[14]。Gal-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的半乳糖凝集素家族成員之一，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制中性粒細(xì)胞滲出，下調(diào)促炎因子表達(dá)，抑制T 細(xì)胞活化，從而降低宿主對(duì)同種異體物的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫耐受[15-16]。Terness等[17]學(xué)者的研究表明，Gal-1通過抑制T細(xì)胞活化并誘導(dǎo)其凋亡的方式來(lái)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的平衡。Molvarec等[18]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Gal-1在子癇前期產(chǎn)婦外周血中的表達(dá)顯著增加。Gal-3在特定的條件下能夠與T細(xì)胞受體結(jié)合，抑制T 細(xì)胞活化；能夠抑制B 細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，減少特異性抗體產(chǎn)生。Rappl等[19]學(xué)者研究表明Gal-3在調(diào)節(jié)胚胎種植部位的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。Blois等[20]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Gal-1和Gal-3基因敲除大鼠的流產(chǎn)率明顯增加，當(dāng)給予外源性Gal-1和Gal-3處理后，大鼠流產(chǎn)率明顯降低。以上結(jié)果說明Gal-1和Gal-3在增強(qiáng)母胎免疫耐受，維持正常妊娠方面發(fā)揮重要作用。

本研究的結(jié)果顯示，觀察組產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，而且子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)明顯高于妊娠期高血壓產(chǎn)婦。說明Gal-1和Gal-3在HDCP產(chǎn)婦胎盤組織中的表達(dá)增加，而且與病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HDCP產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)顯著增加，提示二者可能與HDCP的發(fā)生有關(guān)。由于條件所限，本研究?jī)H檢測(cè)了產(chǎn)婦胎盤組織Gal-1和Gal-3表達(dá)，有關(guān)其參與HDCP發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚未闡明，欲深入探討Gal-1和Gal-3與HDCP的關(guān)系，尚需更多、更全面的研究證實(shí)。