主動脈夾層患者體外循環(huán)術(shù)后紅細胞超微形態(tài)學觀察

鄧 麗，劉宏宇，蘇晶晶，陳 月，胡 光，楊 慧

體外循環(huán)（extracorporeal circulation，ECC）是一種非生理性的心肺支持系統(tǒng)，在機械和化學等因素的共同作用下導致血液損傷，其中表現(xiàn)之一為紅細胞（red blood cell，RBC）發(fā)生溶血或者亞損傷。溶血導致RBC破碎、血紅蛋白漏出、細胞數(shù)量減少，紅細胞比容降低，攜氧量下降，降低組織與細胞的供氧。

亞損傷雖然沒有導致RBC直接破碎，但使其變形性降低，攜氧功能下降，無法順利通過微毛細血管運輸氧氣，最終導致低氧、貧血等不良事件，影響預后［1－3］。 主動脈夾層（arotic dissection，AD） 手術(shù)由于創(chuàng)傷大、病理生理改變復雜、手術(shù)時間長、ECC經(jīng)歷深低溫，大量輸入異體血等，因此涉及到的血液損傷較普通手術(shù)而言更為嚴重，因此AD患者手術(shù)的血液保護就顯得尤為重要。就目前而言有關(guān)RBC損傷的多數(shù)研究都集中在溶血方面，而亞損傷則由于比較難觀察，因此相關(guān)研究較少［4－6］。 本文的研究目的是利用先進的顯微影像技術(shù)觀察AD患者經(jīng)歷ECC后RBC的超微形態(tài)學改變，為RBC損傷和亞損傷提供超微形態(tài)學證據(jù)，也為RBC損傷提供新的評價參數(shù)。

1 材料與方法

1．1 血樣標本收集 收集本中心2106年3月到8月20例AD患者術(shù)前肝素化、術(shù)后即刻靜脈血20 ml。病例入選標準：①AD需要要ECC的患者；②30～60歲之間；③使用小于15天的異體血（文獻證實長時間儲存的異體血RBC形態(tài)發(fā)生改變［7］）。病例排除標準：①血液系統(tǒng)疾?。虎谕庵苎芗膊?；③糖尿病；④一年內(nèi)有腦血栓、心梗病史，一年內(nèi)接受支架介入手術(shù)，近期接受過其它有創(chuàng)手術(shù)的患者；⑤孕婦；⑥肝腎功能不全、接受人工肝、血液透析的患者；⑦肺動脈高壓、肺心病等缺氧性疾??；⑧特殊職業(yè)人群如運動員、潛水員、飛行員 生活在高原地區(qū)的人群；⑨特殊其它疾病，如紅斑狼瘡、皮膚病等。對照組樣本收集（對照組樣本用于對比異常形態(tài)紅細胞）：采集20名健康志愿者靜脈血液20 ml，肝素抗凝（20 U肝素／ml血液）。手術(shù)團隊應用同一標準流程來減少手術(shù)、麻醉以及ECC帶來的選擇性偏倚。本研究經(jīng)哈醫(yī)大一院倫理委員會批準（201751），并獲得健康志愿者以及患者知情同意。兩組患者的基線資料見表1。

表1 基本人口基線材料（n＝20）

掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）樣本制作：取1滴離心清洗后壓積RBC放入含有500 μl 2．5%戊二醛的 PBS 液體中（pH＝7．4，0．01 M）固定過夜，PBS清洗二遍，1%四氧化鋨酸固定15 min，PBS清洗二遍，然后使用100%乙醇脫水兩次，最后取20 μl放在蓋玻片上，室溫干燥，13．3 Pa噴金3次，然后待檢測。每張圖片隨機取5個視野，計算RBC畸形率（%）。觀察RBC在2 000倍、5 000倍下形態(tài)變化。

原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）樣本制作：取1滴離心清洗后壓積RBC 1∶1 000懸浮在 PBS 中，取 10 μl加到蓋玻片上，10 μl 2．5%戊二醛固定15 min，雙蒸水沖洗3次，室溫干燥，待上機。

1．2 AFM掃描方法 AFM掃描使用輕敲模式。探針使用0．01～0．025 Ohm－cm Antimony（n） （RTESP，Bruker，Germany），探針力矩為 40 N／m，共振頻率為300 kHz，齒間半徑為8 nm?？諝庀?，探針隨機掃描6 個細胞，掃描區(qū)域為 20 μm2×20 μm2，10 μm2×10 μm2，1 μm2×1 μm2。 細胞超微掃描后記錄以下參數(shù)：長度，寬度，高度，洞深，平均粗糙度（average roughness，Ra）和均方根粗糙度（root mean square roughness，Rq）。RBC膜表面粗糙度測量RBC邊緣凸起處 1 μm2×1 μm2。

激光共聚焦（laser scanning confocal microscope，LSCM）樣本制作：取100 μl洗滌壓積RBC置入5 ml含有 2．5%戊二醛的 PBS 液體中（pH＝7．4，0．01 M）室溫靜置12 h。細胞混勻后取1 ml，3 000 rpm×5 min，收集大約 7×106個細胞，PBS液洗兩次（3 000 rpm×5 min）去上清，懸浮于 200 μl含有 0．1%的 Tri?tonX－100，室溫孵育 5 min，PBS 液洗兩次（3 000 rpm×5 min）去上清，再懸浮于 200 μl含有 1%BSA的PBS液中，室溫孵育30 min，PBS液洗兩次（3 000 rpm×5 min）去上清，最后細胞懸浮于 200 μl PBS中，加入 10 μl 羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽（500 μl／ml，溶于甲醇中），避光，37℃溫箱孵育60 min，PBS液洗兩次（3 000 rpm×5 min）去上清，細胞最終懸浮在4 ml PBS液里，4℃避光保存，取100 μl加入激光共聚焦小皿中，上機檢測（Zeiss LSM 800，Germany）。

1．3 統(tǒng)計學方法 使用 SPSS 11．0 軟件（SPSS Inc．，Chicago，IL）。RBC畸形率、膜表面參數(shù)符合正態(tài)分布使用均數(shù)±標準差表示，不符合正態(tài)分布使用中位數(shù)表示。P＜0．05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 RBC SEM結(jié)果（微米水平掃描） RBC畸形判定標準根據(jù)2015年國際血液學會推薦指南［8］。與正常對照組相比，AD患者術(shù)前的RBC畸形率沒有明顯改變（P＞0．05）。ECC術(shù)后，RBC畸形率明顯升高，分別為（5．36±1．81）%和（21．97±6．71）%，差異明顯具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。圖1所示在正常成人（圖1 A）RBC基本呈現(xiàn)均勻一致的雙凹圓盤狀，僅有少數(shù)的異常形RBC出現(xiàn)。AD患者術(shù)前（圖1B）RBC異常細胞比例相對增多，經(jīng)歷ECC后，RBC形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分RBC發(fā)生腫脹、固縮、變形甚至破裂（圖1 C、D），異常RBC形態(tài)多種多樣，主要包括棘型紅細胞、口型紅細胞、靶型紅細胞等。

2．2 AFM掃描結(jié)果（納米水平） 納米水平掃描結(jié)果顯示，對照組（圖2 B1、C1）掃描到RBC呈典型雙凹圓盤狀，膜表面光滑、細膩柔韌，隆起高低起伏凸凹有序，排列間隙疏密有度。AD術(shù)前患者（圖2 B2、C2）大多形態(tài)仍保持雙凹圓盤狀，可見形態(tài)不規(guī)則的畸形細胞，細胞膜表面略顯粗糙，但起伏形態(tài)仍相對規(guī)整、有序，個別細胞膜表面可見數(shù)量不等、大小不均等凸起顆粒均勻或不規(guī)則鑲嵌其中。經(jīng)歷ECC手術(shù)后RBC形態(tài)發(fā)生變化（圖2 B3、C3），除正常形態(tài)RBC外，出現(xiàn)較多形態(tài)各異的畸形RBC、破損RBC以及細胞碎片，即使相對形態(tài)正常的細胞表面也可觀察到程度不一的凸起、凹陷、皺褶、壓痕跡，中心凹陷部位也出現(xiàn)程度不一的起伏、凸起，隨著細胞形態(tài)的逐漸改變，RBC凹陷（洞深）逐漸變淺，直至消失。細胞膜表面粗糙，大小形態(tài)不一的顆粒起伏、排列或規(guī)則或紊亂、或呈“條索狀”或呈“沙?！?，形態(tài)各異，深淺不一的膜表面孔洞或規(guī)則或紊亂的排布在顆粒中間。不同形狀的畸形RBC，其膜表面形態(tài)變化有差異。棘型RBC表面顆粒最大、起伏最明顯，孔洞最大，細胞直徑增大，高度增加、表面洞深凹陷降低、細胞表面顆粒增大。

術(shù)前細胞超微結(jié)構(gòu)參數(shù)（長度、寬度、高度）與對照組相比，沒有統(tǒng)計學差異，但膜表面粗糙度（Ra和Rq）和洞深較對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。 ECC 后RBC 膜表面粗糙度（Ra和Rq）和洞深與術(shù)前組和對照組相比，均有明顯的統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

2．3 LSCM掃描結(jié)果 對照組內(nèi)，LSCM可見細胞膜下有一完整的紅色熒光環(huán)，RBC胞漿內(nèi)顏色相對較暗，無大片紅色熒光聚集，提示RBC膜相對完整。即使是畸形RBC（非雙凹圓盤RBC）也存在完整的膜下紅色熒光環(huán)（圖3A）。術(shù)前組LSCM表現(xiàn)與正常組相似（圖3B）。ECC后RBC膜下紅色熒光環(huán)不明顯，F(xiàn)－action分布紊亂，減少，細胞膜呈解聚狀態(tài)，較多紅色熒光物質(zhì)在細胞內(nèi)聚集、分布不均勻，提示RBC膜完整性遭到破壞（圖3C）。

圖1 正常人和AD患者ECC前后RBC電鏡掃描（×2 000）

表2 RBC膜表面參數(shù)（n＝20，±s）

表2 RBC膜表面參數(shù)（n＝20，±s）

注：P值均為與對照組比較；?為與AD術(shù)前比較P＜0．05。

項目 對照組 AD術(shù)前 AD術(shù)后 P值長（μm） 7．63±0．13 7．56±0．21 8．69±1．78 0．264寬（μm） 7．56±1．09 7．30±1．19 7．54±1．29 0．955高（μm） 1．63±0．06 1．65±0．12 1．70±0．77 0．695洞深（μm） 1．33±0．07 1．29±0．06 0．94±0．32? ＜0．01 Rq（nm） 9．30±4．91 16．27±18．11 48．05±6．33? ＜0．01 Ra（nm） 5．46±4．27 12．97±14．85 36．49±5．49? ＜0．01

圖2 對照組的正常人以及AD患者ECC前后RBC的AFM超微掃描

圖3 對照組正常人以及AD患者ECC前后RBC內(nèi)熒光標記F－action LSCM掃描

3 討 論

雖然疾病、ECC、以及其它非生理性因素可以導致RBC形態(tài)發(fā)生改變，但是還缺乏直觀精準的形態(tài)學證據(jù)［9－11］。本實驗利用了先進的顯微鏡技術(shù)從微米到納米水平進行了深層次的觀察研究。SEM和AFM與普通光學顯微鏡相比具有更高的掃描精度，可以觀察到微米到納米水平細胞形態(tài)［12］。特別是AFM可以觀察到納米水平的微觀變化，對于早期形態(tài)改變更具有鑒別意義［13］。本研究中SEM和AFM結(jié)果再次從形態(tài)學角度證實了ECC可以造成RBC破壞，引起RBC形態(tài)改變，出現(xiàn)腫脹、畸形以及破裂的RBC。根據(jù)SEM圖片結(jié)果顯示，筆者推測RBC形態(tài)變化趨勢可能為先是細胞發(fā)生腫脹，然后細胞表面出現(xiàn)異常凸起，凸起的大小、數(shù)目形態(tài)各異，使RBC形態(tài)發(fā)生進一步改變，寬度和高度改變，洞深變淺，RBC表面積和體積比例改變，形成多種形態(tài)的異常細胞（口型、扁平型，橢圓形，棘型等），最終使細胞從雙凹圓盤狀變成為棘型細胞。細胞形態(tài)改變，會使RBC表面積和體積比例失調(diào)，致使細胞攜氧能力下降，造成氧運輸障礙，影響組織和細胞的氧利用，成為術(shù)后低氧血癥的因素之一［14］。另外，SEM雖然可以觀察到微米水平，但是對細胞膜表面的觀察（膜表面粗糙度，洞深、凸起等）仍不如AFM精準，因此，為了更好觀察膜表面的超微結(jié)構(gòu)，使用了納米級別的AFM［15］。通過AFM掃描結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)AD疾病可以造成RBC膜超微結(jié)構(gòu)的損傷，除產(chǎn)生畸形細胞外，特別是在那些相對形態(tài)正常的細胞中（細胞仍呈現(xiàn)雙凹圓盤狀）發(fā)現(xiàn)了AD疾病可以造成RBC膜亞損傷，表現(xiàn)為膜表面粗糙度（Ra和Rq）的增加，對于AD患者為什么會發(fā)生RBC超微形態(tài)的改變，目前還欠缺相關(guān)方面的研究，筆者推測這可能與AD疾病所造成的氧化應激炎性反應、缺血再灌注損傷以及凝血功能紊亂等因素有關(guān)。在經(jīng)歷ECC后的RBC，即使形態(tài)相對正常，膜表面粗糙度也明顯增加，AFM檢測結(jié)果提供了RBC亞損傷新的形態(tài)學證據(jù)。膜表面粗糙度（Ra和Rq）由于其超高的敏感性，可以發(fā)現(xiàn)早期改變，因此可以作為細胞損傷新的評價參數(shù)［16］。ECC造成血液損傷的研究很多，關(guān)于損傷機制也比較明確［17－19］，但對于膜表面超微結(jié)構(gòu)的改變研究文獻報告不多，本研究通過觀察膜表面粗糙度的觀察，為RBC亞損傷提供了新的形態(tài)學證據(jù)。絲狀肌動蛋白（F－action）－細胞膜骨架的主要成份，均勻分布在細胞膜表面，通過與血影蛋白游離端的結(jié)合參與膜骨架結(jié)構(gòu)的形成，是維持RBC膜完整性的重要蛋白之一［20］；本研究利用了鬼筆環(huán)肽熒光標記F－action的方法觀察了AD疾病以及ECC下RBC膜完整情況。結(jié)果表明AD疾病雖然可以出現(xiàn)細胞膜表面粗糙度的增加和RBC形態(tài)的改變，但基本不影響F－action分布、RBC膜骨架沒有發(fā)生解聚、細胞膜結(jié)構(gòu)完整。但是ECC可以導致F－action分布紊亂、RBC膜骨架解聚、RBC膜形態(tài)完整性遭到破壞，相關(guān)損傷機制還有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

先進顯微技術(shù)為AD和ECC下RBC損傷和亞損傷提供了新的超微形態(tài)學證據(jù)。RBC表面粗糙度（Ra和Rq）由于其超高的敏感性可以作為新的參數(shù)來評估RBC損傷，為今后相關(guān)血液保護研究提供了新的評價參數(shù)。