復(fù)方丹參滴丸對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型大鼠的療效觀察

陸秉文 吳星偉

【實(shí)驗(yàn)研究】

復(fù)方丹參滴丸對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型大鼠的療效觀察

陸秉文 吳星偉

Accepted date：Jul 15，2014

From theDepartmentofOphthalmology，ShanghaiFirstPeople’sHospital，Shanghai200080，China

Responsible author：WU Xing-Wei，E-mail：wxweye@sina.com

復(fù)方丹參滴丸；視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；視網(wǎng)膜電流圖；大鼠

目的 探究復(fù)方丹參滴丸對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)的影響。方法 將42只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)、模型組(18只)和治療組(18只)。模型組和治療組采用前房灌注加壓建立大鼠RIRI模型，治療組RIRI后立即給予復(fù)方丹參滴丸(450 mg·kg-1·d-1)灌胃，連續(xù)7 d，模型組和正常對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。觀察RIRI后24 h、7 d視網(wǎng)膜電流圖的改變，并取視網(wǎng)膜行組織病理學(xué)觀察。測(cè)量RIRI后24 h、7 d視網(wǎng)膜各層厚度，同時(shí)計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 RIRI后24 h及7 d，模型組視網(wǎng)膜電流圖的b波振幅分別為(92.33±24.36)μV及(101.28±21.97)μV，較正常對(duì)照組大鼠測(cè)量到的(215.40±35.91)μV顯著降低，而治療組的b波振幅分別為(137.07±22.71)μV及(166.24±16.72)μV，較模型組顯著好轉(zhuǎn)(均為P<0.05)；各組a波與b波的變化趨勢(shì)相同。大鼠RIRI后24 h，模型組全層視網(wǎng)膜高度水腫，可見大量空泡變性，RIRI后7 d，視網(wǎng)膜厚度明顯變薄，而治療組大鼠視網(wǎng)膜的組織病理學(xué)損害較模型組均明顯減輕。結(jié)論 復(fù)方丹參滴丸可從形態(tài)學(xué)及功能學(xué)上減輕大鼠RIRI損傷。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(11)：1030-1034]

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)是目前眼科臨床常見的病理生理損傷，通常發(fā)生在視網(wǎng)膜血管阻塞等缺血性眼底病中，即各種原因造成的不同程度的視網(wǎng)膜缺血，在血供恢復(fù)后，視網(wǎng)膜反而受到更為嚴(yán)重的不可逆性損傷，造成視功能的下降[1]。RIRI的機(jī)制復(fù)雜，主要涉及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)[2-3]、細(xì)胞內(nèi)鈣超載[4]、興奮性氨基酸[5]、炎癥反應(yīng)[6]及細(xì)胞凋亡[7]等。因此，對(duì)RIRI防治的探究已成為當(dāng)今科研和臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。越來越多的研究表明，藥物對(duì)RIRI具有一定的保護(hù)作用。復(fù)方丹參滴丸是由丹參、三七中提取有效成分，配以冰片制成的新型純中成藥滴丸劑，具有清除氧自由基、阻滯鈣通道、穩(wěn)定細(xì)胞膜等作用，長(zhǎng)期以來用于冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療中，具有明顯療效[8]。本實(shí)驗(yàn)采用近年來國內(nèi)外常用的前房灌注加壓建立大鼠RIRI模型，通過檢測(cè)視網(wǎng)膜電流圖(electroretinogram，ERG)，并觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變，擬探究復(fù)方丹參滴丸是否能減輕大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注所致的損傷，從而為臨床用藥提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年SD大鼠42只，體質(zhì)量200～350 g，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于普通級(jí)環(huán)境，用裝有墊料的聚碳酸酯盒飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。動(dòng)物房通風(fēng)良好，室溫控制在20～26 ℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%，光照12 h明暗交替。大鼠隨機(jī)抽簽分為正常對(duì)照組(6只)、模型組(18只)和治療組(18只)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 復(fù)方丹參滴丸(棕色薄膜衣滴丸，每丸27 mg)由天津天士力制藥股份有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：110105，溶液配制：將滅菌注射用水加熱至36～38 ℃，將定量的復(fù)方丹參滴丸溶入加熱的注射用水中，充分振蕩溶解，配制成45 g·L-1的復(fù)方丹參滴丸溶液。Espion單焦、多焦電生理一體機(jī)(Diagnosys LLC D2/5)；光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS BH-2)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及處理 采用前房灌注加壓建立大鼠RIRI模型。模型組和治療組大鼠均建模，具體方法為：10 g·L-1戊巴比妥鈉(7 mL·kg-1體質(zhì)量)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠；將大鼠固定于加熱板上(俯臥位)，保持實(shí)驗(yàn)中溫度恒定；每只動(dòng)物均取一眼(標(biāo)記眼)進(jìn)行造模，滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液及鹽酸奧布卡因滴眼液以散大瞳孔并進(jìn)行角膜表面麻醉；將30 G注射針頭自大鼠顳側(cè)角膜緣向前房?jī)?nèi)刺入，避免傷及角膜、晶狀體及虹膜；固定灌注針頭，迅速升高預(yù)先與針頭相連的250 mL生理鹽水輸液袋，使液平面距離術(shù)眼的垂直距離為150 cm。此時(shí)大鼠前房眼壓為110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)。肉眼觀察術(shù)眼：球結(jié)膜蒼白，虹膜迅速變白，提示視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈血供已被完全阻斷；持續(xù)60 min，隨后降低生理鹽水輸液袋高度，拔出灌注針頭。肉眼觀察術(shù)眼：球結(jié)膜及虹膜顏色迅速恢復(fù)正常，提示視網(wǎng)膜原先被阻斷的血供重新恢復(fù)，形成再灌注；術(shù)畢，迪可羅眼膏涂眼，以保持角膜濕潤(rùn)、預(yù)防感染。

確認(rèn)大鼠RIRI后立即給予相應(yīng)劑量的藥物或溶媒：治療組按450 mg·kg-1復(fù)方丹參滴丸灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d；模型組及正常對(duì)照組均灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.2 ERG檢測(cè) RIRI后24 h，模型組和治療組各隨機(jī)選取9只大鼠、正常對(duì)照組隨機(jī)選取3只大鼠行雙眼ERG檢測(cè)，各組其余大鼠均于RIRI后7 d行雙眼ERG檢測(cè)。將動(dòng)物轉(zhuǎn)移至暗房過夜，所有步驟均在暗紅燈下操作。用10 g·L-1戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠，滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液及鹽酸奧布卡因滴眼液散瞳并行角膜表面麻醉，使用Espion單焦、多焦電生理一體機(jī)進(jìn)行ERG測(cè)定。記錄電極置于角膜中央，在角膜表面涂適量迪可羅眼膏，參考電極以及接地電極分別置于大鼠的兩頰及尾部皮下。刺激器型號(hào)D300，記錄參數(shù)為：刺激光強(qiáng)：0.01 c·d-1、3.00 c·d-1、10.00 c·d-1；循環(huán)時(shí)間：5 s、15 s、20 s；采樣頻率：1000 Hz；通頻帶：0.312～300.000 Hz。記錄ERG的 a波及b波振幅：a波的波幅值為基線到a波波谷這段距離代表的振幅；b波的波幅值為a波波谷到b波波峰這段距離代表的振幅。每個(gè)波幅值的單位均為微伏(μV)。

1.2.3 大鼠眼球病理切片的制作及觀察 10 g·L-1戊巴比妥鈉過量腹腔內(nèi)注射處死ERG檢測(cè)后的大鼠(RIRI后24 h及7 d；模型組與治療組每組9只，正常對(duì)照組3只)，用5-0線在大鼠角膜上方12點(diǎn)處的角鞏膜緣縫線標(biāo)記，完整摘出術(shù)眼；制作石蠟包埋切片，行HE染色、光鏡觀察及TUNEL檢測(cè)。切片：經(jīng)縫線與視神經(jīng)矢狀面做5 μm連續(xù)石蠟切片，每個(gè)標(biāo)本切片2張，切片范圍為距視盤500 μm處兩側(cè)。視網(wǎng)膜測(cè)厚：測(cè)量視網(wǎng)膜全層厚度(retinal total length，RTL)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)厚度、內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)厚度以及內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)厚度，每張切片各測(cè)3次取其平均值。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)切片每200 μm長(zhǎng)度內(nèi)RGC的個(gè)數(shù)，每張切片各測(cè)3次，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 ERG檢測(cè)結(jié)果 大鼠RIRI后24 h及7 d，各組大鼠均可記錄到典型的ERG標(biāo)準(zhǔn)混合反應(yīng)圖形(圖1-圖2)，記錄各組大鼠雙眼ERG的a波及b波振幅，具體見表1。由表1知，大鼠RIRI后不同時(shí)間點(diǎn)，模型組ERG的a波及b波振幅均明顯降低，與正常對(duì)照組相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；治療組ERG的a波及b波振幅雖然低于正常對(duì)照組，但與模型組相比顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.2 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察及檢測(cè)結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色切片可見，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜分層清晰，各層結(jié)構(gòu)無明顯異常(圖3A)；視網(wǎng)膜GCL的細(xì)胞呈單層排列，胞核為圓形或橢圓形；IPL呈疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；INL由3～5層細(xì)胞核較大的細(xì)胞構(gòu)成；外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)較薄，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)沒有IPL明顯；外核層(outer nuclear layer，ONL)由8～10層排列緊密、細(xì)胞核較小的細(xì)胞構(gòu)成。大鼠RIRI后24 h，模型組全層視網(wǎng)膜高度水腫，GCL大量空泡變性，IPL及INL水腫明顯(圖3B)；治療組視網(wǎng)膜各層輕度水腫，結(jié)構(gòu)較清晰，GCL細(xì)胞排列較疏松但完整，可見空泡變性，IPL細(xì)胞分散，偶見空泡(圖3C)。RIRI后7 d，模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次與正常對(duì)照組大致相似，細(xì)胞排列較整齊，但視網(wǎng)膜厚度變薄，以INL及IPL厚度降低最為明顯；治療組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次亦與正常對(duì)照組大致相似，細(xì)胞排列整齊，視網(wǎng)膜厚度雖亦有變薄，但與模型組相比程度明顯減輕(圖4)。大鼠RIRI后24 h及7 d，視網(wǎng)膜各層厚度及RGC計(jì)數(shù)結(jié)果見表2和表3。RIRI后24 h，視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)可見明顯異常；RIRI后7 d，視網(wǎng)膜厚度明顯變薄。

表1 各組大鼠RIRI后不同時(shí)間ERG中a波、b波振幅情況

Table 1 Changes of a-wave and b-wave amplitudes at different time after RIRI

±s，U/μV)

Figure 1 ERG at 24 hours after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group.Figure 2 ERG at 7 days after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group 圖1 大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后24 h ERG。A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：治療組。圖2 大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后7 d ERG。A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：治療組

Figure 3 Histopathological examination of retina at 24 hours after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group 大鼠RIRI后24 h視網(wǎng)膜形態(tài)變化。A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：治療組

Figure 4 Histopathological examination of retina at 7 days after RIRI in rats.A：Sham group；B：Model group；C：Treatment group 大鼠RIRI后7 d視網(wǎng)膜形態(tài)變化。A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：治療組

表2 RIRI后24 h各組大鼠視網(wǎng)膜各層厚度及RGC計(jì)數(shù)

Note：Compared with the sham group，aP<0.05；Compared with the model group，bP<0.05

表3 RIRI后7 d各組大鼠視網(wǎng)膜各層厚度及RGC計(jì)數(shù)

Note：Compared with the sham group，aP<0.05；Compared with the model group，bP<0.05

3 討論

視網(wǎng)膜對(duì)缺血缺氧耐受性差，易遭受各種病理因子的損害，產(chǎn)生多種多樣的視網(wǎng)膜疾病，而RIRI是指視網(wǎng)膜在恢復(fù)血供后，反而出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至發(fā)生不可逆損傷，即再灌注并未緩解由缺血造成的細(xì)胞損傷，反而加劇了細(xì)胞死亡[1]。由于RIRI的機(jī)制是多方面的，因此，通過建立RIRI模型，研究其發(fā)生機(jī)制及防治方法在國內(nèi)外備受關(guān)注。

目前RIRI模型的建立通常采用兩種方法：血管結(jié)扎模型以及升高眼壓模型。結(jié)扎視網(wǎng)膜中央動(dòng)靜脈以及視神經(jīng)[9]或同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈[10]雖然可以造成視網(wǎng)膜組織的完全缺血，但手術(shù)操作復(fù)雜、動(dòng)物死亡率高、干擾因素多，因此近年來已較少應(yīng)用。

本研究參照Büchi等[11]的方法，通過前房加壓灌注升高眼壓的方法建立大鼠RIRI模型，使眼壓超過體循環(huán)收縮壓或達(dá)到一定的數(shù)值，造成整個(gè)視網(wǎng)膜的缺血。Büchi等[11]證明：增加眼壓引起的視網(wǎng)膜損傷是由于缺血再灌注所致。這種方法較血管結(jié)扎法簡(jiǎn)便，缺血持續(xù)時(shí)間易于控制，是目前研究視網(wǎng)膜缺血性疾病廣泛應(yīng)用的模型。本研究前房加壓灌注過程中均可觀察到大鼠球結(jié)膜蒼白、角膜水腫、視網(wǎng)膜顏色變白、視網(wǎng)膜血管明顯變細(xì)等缺血改變；而降低生理鹽水袋的高度后，大鼠球結(jié)膜、角膜、視網(wǎng)膜均恢復(fù)正常，提示大鼠RIRI模型成功建立。

ERG是評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能的一種有效、客觀且無創(chuàng)的檢查方法，廣泛用于視網(wǎng)膜疾病的臨床以及科研中[12-13]。ERG的a波及b波振幅是反映視網(wǎng)膜功能的兩個(gè)重要指標(biāo)：a波起源于視網(wǎng)膜外層的神經(jīng)元，主要反映視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的電活動(dòng)；b波起源于雙極細(xì)胞及Müller細(xì)胞，反映了視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞的電活動(dòng)[14]。即使視網(wǎng)膜缺血組織形態(tài)上無明顯變化，b波仍能敏感反映出缺血對(duì)視網(wǎng)膜造成的損傷，因此是缺血模型實(shí)驗(yàn)研究的常用評(píng)價(jià)指標(biāo)[15-16]。在本研究中，模型組ERG的a波及b波振幅均明顯低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；復(fù)方丹參滴丸治療組ERG的a波及b波振幅較模型組均有不同程度的恢復(fù)，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，說明復(fù)方丹參滴丸干預(yù)治療對(duì)RIRI可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI可致視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常。RIRI后24 h的視網(wǎng)膜組織病理學(xué)切片HE染色顯示：正常對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰、完整，模型組視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞明顯水腫，而治療組視網(wǎng)膜水腫程度較模型組明顯減輕。RIRI后7 d的視網(wǎng)膜組織切片HE染色顯示：模型組與正常對(duì)照組相比，雖然細(xì)胞形態(tài)、排列大致正常，其視網(wǎng)膜厚度明顯變??；治療組與模型組相比，視網(wǎng)膜厚度變薄程度明顯減輕。以上結(jié)果提示復(fù)方丹參滴丸干預(yù)治療對(duì)RIRI所致的視網(wǎng)膜形態(tài)損傷可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

復(fù)方丹參滴丸是在現(xiàn)代高科技條件下，嚴(yán)格按照中醫(yī)君、臣、佐、使的藥物配伍配比制成的新型純中藥，其中丹參為君藥，三七為臣藥，冰片為佐使藥，長(zhǎng)期以來用于冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療中[8]。最新研究表明，復(fù)方丹參滴丸在其他組織器官缺血再灌注損傷中有保護(hù)作用，可減少缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡[17-18]，并可改善缺血再灌注所致的肝臟微循環(huán)障礙和肝損傷[19]。從丹參中提取的水溶性成分丹參素具有抗氧化、抗炎、清除自由基等作用[20]；三七中的主要活性成分——三七總皂苷(PNS)，具有抗氧化、抗炎、阻滯鈣通道等作用[21]；而冰片則能改善血腦屏障通透性，提高中藥成分在組織中的濃度。

本研究從功能學(xué)及形態(tài)學(xué)兩方面證明復(fù)方丹參滴丸對(duì)RIRI具有較好的保護(hù)作用，是一種治療視網(wǎng)膜缺血性疾病的有效藥物，其作用的具體機(jī)制有待更深入研究。

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date：Apr 9，2014

Protective effects of compound danshen dripping pills on retinal ischemia-reperfusion injury in Rats

LU Bing-Wen，WU Xing-Wei

compound danshen dripping pills；retinal ischemia-reperfusion injury；cell apoptosis；electroretinogram；rat

Objective To study the effects of compound danshen dripping pills on retinal ischemia-reperfusion injury(RIRI) in rats.Methods Forty-two adult healthy SD rats were randomly divided into 3 groups：Sham group(6 rats)，model group(18 rats) and treatment group(450 mg·kg-1·d-1)(18 rats).The model of RIRI was established by increasing the intraocular pressure via cannulation into the anterior chamber.Electroretinogram(ERG) was recorded at 24 hours and 7 days after RIRI，respectively，then pathological changes of the retina were observed with light microscope.Thicknesses of the retinal layers and RGC cell counts were calculated at 24 hours and 7 days respectively after RIRI.Results At 24 hours and 7 days after RIRI，the b-wave amplitudes of the model group were (92.33±24.36)μV and (101.28±21.97)μV，respectively，which were much lower than the sham group (215.40±35.91)μV.While the b-wave amplitudes of the treatment group were (137.07±22.71)μV and (166.24±16.72)μV，respectively，which were higher than the model group(allP<0.05).In the model group，all layers of the retinas were highly edema with enormous vacuolar degeneration at 24 hours after RIRI，and the thicknesses of retinas were greatly reduced at 7 days after RIRI，as shown in the HE analysis.These insults were reversed to some extent in the compound danshen dripping pills treatment group.Conclusion Compound danshen dripping pills may have a protective effect on the retinal morphology as well as the retinal function after RIRI.

陸秉文，吳星偉.復(fù)方丹參滴丸對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型大鼠的療效觀察[J].眼科新進(jìn)展， 2014，34(11)：1030-1034.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0285

陸秉文，女，1988年1月出生，上海人，在讀博士研究生。聯(lián)系電話：18916121579；E-mail：704487389@qq.com

About LU Bing-Wen：Female，born in January，1988.Doctoral candidate.Tel：18916121579；E-mail：704487389@qq.com

2014-04-09

200080 上海市，上海市第一人民醫(yī)院眼科

吳星偉，E-mail：wxweye@sina.com

修回日期：2014-07-15

本文編輯：盛麗娜

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1030-1034]