海爾福干預(yù)對(duì)鋁暴露大鼠海馬組織阿爾茨海默病相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

李根亮 李 韜 胡紅柳 許苡僥 謝孟林

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

鋁會(huì)大量存在于腦神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)并引起阿爾茨海默病(AD)〔1〕。AD治療上西醫(yī)主要采用乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑、自由基清除劑及抗氧化劑、干預(yù)tau蛋白磷酸化等藥物，但因不良反應(yīng)明顯或價(jià)格昂貴，患者難以堅(jiān)持用藥。中醫(yī)中藥在治療AD方面由于不良反應(yīng)少、成本低廉而日益受到重視。研究中藥治療AD的分子機(jī)制，并通過(guò)干預(yù)老年斑(SP)、NFT的形成，尋找療效明確、副作用少的中藥，具有十分重要的意義。海爾福口服液為復(fù)方制劑(茯苓、甘草、薏仁、金銀花等)。海爾福能改善鋁致癡呆動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力和保護(hù)腦神經(jīng)等，但其作用機(jī)制還不清楚〔2〕。本研究分析AD大鼠海馬組織勻漿中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42、AchE、總tau蛋白(T-tau)及糖原合酶激酶(GSK)-3β的含量或活性的變化，以闡明海爾福干預(yù)AD形成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 AlCl3·6H2O(廣東西隴化工有限公司)，T-SOD、Aβ1～42、AchE、T-tau及GSK-3β試劑盒(南京建成生物工程研究所)，海爾?？诜河捎医褡遽t(yī)學(xué)院張樹球教授惠贈(zèng)。

1.2動(dòng)物分組及處理 鼠齡10個(gè)月的健康清潔級(jí)雄性SD大鼠18只，體重(250±10)g，購(gòu)自右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠分組和飼喂參考李根亮等〔3〕方法。隨機(jī)分為對(duì)照組、鋁暴露組、海爾福干預(yù)組，每組6只。每天正常飼喂大鼠普通飼料。對(duì)照組正常給水，鋁暴露組和海爾福干預(yù)組隔日交替給予添加AlCl3的水和不添加AlCl3的水。海爾福干預(yù)組與鋁暴露組不同的是在不添加AlCl3水中添加海爾?？诜?。水中AlCl3和海爾福口服液的濃度根據(jù)每日大鼠需水量控制，其中AlCl3劑量為280 mg·kg-1·d-1，海爾福口服液劑量為0.8 ml·kg-1·d-1。飼喂6個(gè)月。

1.3大鼠海馬組織生化指標(biāo)檢測(cè) 飼喂6個(gè)月后，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠進(jìn)行解剖，取海馬組織加4℃預(yù)冷的生理鹽水，低溫勻漿，按照各試劑盒使用說(shuō)明書，離心取海馬組織勻漿的上清液，檢測(cè)海馬組織T-SOD活性及Aβ1～42、AchE、T-tau、GSK-3β含量。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，多重比較用最小顯著差數(shù)法。

2 結(jié) 果

2.1海馬組織中T-SOD活性 與對(duì)照組相比，鋁暴露組海馬組織中T-SOD活性極顯著下降(P<0.01)；海爾福干預(yù)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而與鋁暴露組存在極顯著差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組海馬組織中T-SOD、AchE、Aβ1～42、T-tau、GSK-3β含量比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.01；與鋁暴露組比較:2)P<0.01

2.2海馬組織Aβ1～42含量及AchE活性 與對(duì)照組相比，鋁暴露組海馬組織Aβ1～42含量及AchE活性顯著升高(P<0.01)；但海爾福干預(yù)組則與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而與鋁暴露組存在顯著差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3海馬組織中T-tau及GSK-3β含量 與對(duì)照組相比，鋁暴露組海馬組織T-tau及GSK-3β含量都極顯著升高(P<0.01)，海爾福干預(yù)組海馬組織中T-tau及GSK-3β含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，而與鋁暴露組差異極顯著(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3 討 論

AD的發(fā)病機(jī)制可能是多方面的，涉及的蛋白(酶)分子也特別多，如T-SOD、Aβ1～42、AchE、T-tau及GSK-3β等〔4～8〕，但迄今尚沒(méi)有定論。SOD是一種能清除機(jī)體內(nèi)超氧自由基的抗氧化酶，也具有防止Aβ對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性的作用〔4〕。超氧自由基能破壞細(xì)胞膜，產(chǎn)生SP等；超氧自由基侵蝕腦細(xì)胞則可能使人易患AD；超氧自由基還能通過(guò)攻擊正在復(fù)制的基因而引起基因突變。因此，SOD在減少超氧自由基對(duì)機(jī)體組織造成的損傷從而預(yù)防腦功能識(shí)別障礙中發(fā)揮著重要的作用〔9,10〕。AchE則具有通過(guò)神經(jīng)再生修復(fù)受損神經(jīng)的功能，但AchE的大量積累則會(huì)引起行動(dòng)遲緩〔5〕。如直接注射AchE到黑質(zhì)內(nèi)的大鼠會(huì)表現(xiàn)行動(dòng)遲緩和木僵狀態(tài)。Aβ生理情況下是低濃度的，因而是無(wú)神經(jīng)毒性的。但病理狀態(tài)下，大量表達(dá)的Aβ在神經(jīng)組織中沉積形成SP，并通過(guò)激活GSK-3β來(lái)磷酸化tau蛋白產(chǎn)生神經(jīng)毒性〔6〕。Aβ沉積通常由β-淀粉樣前體蛋白(APP)基因突變或異常剪切引起〔7,11〕。APP基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，因此該基因可能通過(guò)基因的不同編輯和不同剪切方式產(chǎn)生不同亞型。在正常腦組織中表達(dá)的亞型雖然有多種，但主要是APP695；而AD患者的腦中則出現(xiàn)不同亞型比例失衡的現(xiàn)象，生成大量的Aβ1～42。tau蛋白是一種在多種生物體內(nèi)廣泛存在的微管相關(guān)蛋白家族(MAP)成員。人類神經(jīng)元中表達(dá)的tau蛋白與神經(jīng)細(xì)胞微管組裝、穩(wěn)定及物質(zhì)傳遞相關(guān)。tau蛋白的活性受磷酸化和脫磷酸化調(diào)節(jié)，過(guò)度磷酸化會(huì)導(dǎo)致微管解聚及tau蛋白異常聚集形成NFT，在神經(jīng)元內(nèi)形成異常的細(xì)胞骨架，影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能〔8〕。導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化的機(jī)制雖然還不清楚，但大量的實(shí)驗(yàn)表明，AD腦中蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性調(diào)節(jié)失衡，是使tau蛋白過(guò)度磷酸化的重要因素。GSK-3β是目前研究比較多的、也是最有效的磷酸化tau蛋白激酶之一〔6,12〕。因此某些因素異常導(dǎo)致的GSK-3β過(guò)表達(dá)會(huì)顯著增加海馬組織細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平。

由于T-SOD能夠通過(guò)減少機(jī)體內(nèi)的超氧自由基來(lái)防止后者對(duì)機(jī)體的損傷，因此海馬組織中T-SOD活性的下降說(shuō)明大鼠海馬組織清除超氧自由基的能力下降，超氧自由基可能在一定程度上損傷了海馬組織。過(guò)量的超氧自由基不僅損傷海馬組織細(xì)胞，還可能破壞DNA結(jié)構(gòu)引起基因突變。Aβ1～42含量的增加則說(shuō)明大鼠海馬組織中有Aβ1～42沉積，即此時(shí)的海馬組織內(nèi)可能有SP形成，同時(shí)也說(shuō)明海馬組織中GSK-3β活性可能有所上升。AchE活性上升則說(shuō)明海馬組織由于受到損傷而通過(guò)神經(jīng)再生對(duì)海馬組織進(jìn)行損傷修復(fù)，但大量的AchE則使大鼠行動(dòng)遲緩。T-tau含量增加一方面來(lái)自于磷酸化tau蛋白(p-tau)的增加，另一方面則來(lái)自于非磷酸化的tau蛋白增加，前者的增加與GSK-3β含量升高相一致，后者的增加則為GSK-3β的激酶活性提供底物，以保證p-tau大量生成。這一結(jié)果說(shuō)明，鋁暴露大鼠的海馬組織內(nèi)可能由于p-tau的增加而產(chǎn)生了NFT。

由此推測(cè)，鋁致AD的可能分子機(jī)制：(1)鋁在機(jī)體組織內(nèi)積累引起了海馬組織內(nèi)T-SOD活性(含量)降低及APP基因編輯和剪切方式的改變；(2)T-SOD活性(含量)降低導(dǎo)致海馬組織中超氧自由基濃度的上升，從而損傷海馬組織內(nèi)的神經(jīng)元(包括細(xì)胞體及突起)，并可能引起APP基因的變異從而導(dǎo)致Aβ1～42含量增加；(3)APP基因突變及剪接方式改變則引起海馬組織Aβ不同亞型表達(dá)比例失衡，Aβ1～42大量生成；(4)神經(jīng)組織的損傷誘發(fā)AchE活性(含量)的自我保護(hù)性增加以修復(fù)受損的神經(jīng)組織，從而產(chǎn)生大量的NFT；(5)Aβ1～42含量增加導(dǎo)致SP的形成并大量激活GSK-3β，后者對(duì)tau蛋白進(jìn)行磷酸化生成更多SP，受損神經(jīng)組織的大量修復(fù)同樣可能產(chǎn)生NFT；(6)海馬組織SP和NFT大量生成導(dǎo)致AD；(7)tau蛋白大量磷酸化則使組織細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)生非磷酸化tau蛋白以滿足細(xì)胞的正常需求，這本質(zhì)上又為GSK-3β提供了催化底物，非磷酸化的tau蛋白的不斷產(chǎn)生和p-tau大量積累引起T-tau含量的異常增加。見(jiàn)圖1。

X，海爾福干預(yù)位點(diǎn)圖1 鋁致AD的可能分子機(jī)制

本文表明，海爾福干預(yù)鋁致AD的可能分子機(jī)制是通過(guò)降低鋁在機(jī)體組織內(nèi)的積累防止海馬組織內(nèi)T-SOD活性(含量)降低、APP基因的異常編輯和剪切及APP基因的可能變異，從而防止海馬組織的損傷及Aβ1～42含量增加。由于沒(méi)有神經(jīng)組織的顯著損傷，因而不會(huì)誘發(fā)海馬組織內(nèi)AchE活性的自我保護(hù)性增加以修復(fù)受損的神經(jīng)組織及NFT的生成。沒(méi)有Aβ1～42含量的顯著增加則不會(huì)導(dǎo)致SP形成及GSK-3β含量顯著升高，因此tau蛋白不會(huì)被過(guò)度磷酸化而產(chǎn)生更多的SP，T-tau含量也不會(huì)異常增加。