藜麥組織培養(yǎng)快速繁殖體系建立研究

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(貴州省農業(yè)科學院旱糧研究所， 貴陽 550006)

藜麥(ChenpodiumquinoaWild.)別稱藜谷、南藜麥等，是原產于南美洲的1年生藜科雙子葉作物，在玻利維亞、秘魯、智利等地廣泛栽培，被印加人稱為“糧食之母”[1-2]。藜麥中蛋白質含量較高，可作為主要的蛋白質來源，在穩(wěn)定的食物供應和營養(yǎng)補充品中起著至關重要的作用。因為藜麥對多種非生物脅迫具有抗性，所以種子具有特殊的營養(yǎng)品質[3-4]，對干旱和低溫具有較強的抗性，與其它谷物相比，藜麥籽粒缺乏面筋，蛋白質、脂類和碳水化合物的平衡比例較高，富含人體所需的必需氨基酸、礦質營養(yǎng)、多酚、黃酮等生物活性物[4-6]，營養(yǎng)潛力巨大。因此，美國航空航天局(NASA)將藜麥列為“登月候選作物”、宇航員理想的“太空糧食”，聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織(FAO)列出藜麥作為確保全球糧食安全的重要作物，宣布2013作為國際藜麥年[7-8]。目前，藜麥作為一種“超級食品”的市場需求已擴展到日本、北美洲和歐洲，成為全球炙手可熱的商品。藜麥及其衍生品已成為美國天然養(yǎng)生食品商店中主打減肥、養(yǎng)生及保健的高端產品，風靡美國，開發(fā)利用前景較高[8]。

南美洲作為藜麥的主產地，占全球藜麥總產的95%左右[9]，近年來，我國甘肅、山西、河北、吉林等地，通過田間栽培試驗，選育了一批優(yōu)質穩(wěn)定且適合當地生態(tài)區(qū)域的新材料[10-11]。但是，我國對于藜麥基礎研究主要集中在藜麥的化學組成、抗逆特性、栽培方法等方面，處于剛剛起步階段[13]。俞涵譯等[14]以9個藜麥品種為材料，對藜麥莖段愈傷組織進行誘導以及增殖體系進行優(yōu)化，篩選出最適的誘導培養(yǎng)基類型。其他有關藜麥組織培養(yǎng)研究報道罕見，因此，開展藜麥的組織培養(yǎng)研究十分必要。本試驗以臺灣藜麥的莖段作為外植體，在提高種子發(fā)芽率的基礎上，對影響藜麥莖段愈傷組織分化和不定芽增殖的關鍵因素進行研究，進一步為藜麥的遺傳轉化和分子遺傳研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為臺灣紅黎，由貴州省農業(yè)科學院旱糧研究所提供。自配MS、1/2 MS，不同濃度的6-BA、NAA、2-IP試劑。

1.2 藜麥組培苗的選育

選取籽粒飽滿的藜麥種子，28 ℃條件下水浴2 h后冷卻至室溫；在超凈工作臺上，用75%的乙醇溶液消毒30 s，無菌水沖洗1次，轉入20%次氯酸鈉溶液中消毒20 min，無菌水沖洗4次，晾干后接種到未處理的MS培養(yǎng)基上，37 ℃暗培養(yǎng)2 d，隨后轉入16 h/8 h(光照/黑暗)條件下培養(yǎng)7 d，獲得無菌苗備用。

1.3 藜麥愈傷組織的誘導培養(yǎng)

在超凈工作臺上，將1.2中培養(yǎng)獲得的無菌苗從培養(yǎng)皿中取出，莖段剪成1.0 cm左右小段后平放、子葉側插，置于不同處理條件的培養(yǎng)基中(表1)培養(yǎng)，每個處理接種40個莖段，3次重復。接種1周后統(tǒng)計藜麥莖段愈傷組織的誘導率及愈傷組織生長狀況。

誘導率(%)=(產生愈傷組織的個數/接種的個數)×100%。

表1 藜麥愈傷組織誘導培養(yǎng)基配方設計

培養(yǎng)基編號基本培養(yǎng)基生長調節(jié)劑6-BA(mg/L)NAA(mg/L)10021.00.131.00.241.00.35MS1.50.161.50.271.50.382.00.192.00.2102.00.3

1.4 藜麥愈傷組織的誘導分化培養(yǎng)

挑選生長良好均勻的藜麥莖段愈傷組織，轉接到表2的激素培養(yǎng)基中，每個處理轉接10塊莖段愈傷組織，3次重復，培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計不定芽的分化率與不定芽生長情況，篩選出最佳培養(yǎng)基。

分化率(%)=(分化不定芽愈傷組織塊數/轉移的愈傷組織塊數)×100%。

1.5 生根培養(yǎng)

待藜麥不定芽長至3～5 cm 后在超凈工作臺上將其切下，將其轉移到1/2 MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。

1.6 移 栽

生根培養(yǎng)結束后，挑選單苗長出正常的潔白色短根、苗高7 cm左右的的藜麥組培生根苗，移栽至溫室大棚，進行煉苗；將營養(yǎng)土、草炭土按不同比例充分混勻并消毒，隨后將藜麥生根苗移栽至上述基質中。移栽定植后的小苗，時刻監(jiān)測記錄周圍環(huán)境中溫度、濕度、光照，及時噴水、調溫、防病蟲害，創(chuàng)造適宜藜麥幼苗生存的外界環(huán)境，提高藜麥再生苗的成活率。

2 結果與分析

2.1 藜麥外植體的獲得

將消毒滅菌后的藜麥莖段及子葉分別接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，3 d時莖段切口處變淡黃色且明顯的愈傷組織產生，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，莖段愈傷組織質地均勻且體積增大，形成蓬松的球狀(見圖1-A、C)，30 d后統(tǒng)計莖段及子葉愈傷組織的生長狀況，停止生長或者未被誘導的則不再形成愈傷組織。由圖1-A、1-B看出，藜麥的莖段、子葉經誘導都能形成愈傷組織，但是莖段的誘導成功率可達75%，因此后續(xù)試驗選擇藜麥莖段作為外植體。

表2 藜麥繼代增殖培養(yǎng)基配方設計

培養(yǎng)基編號基本培養(yǎng)基生長調節(jié)劑6-BA(mg/L)NAA(mg/L)2-IP(mg/L)11.00.41.021.00.61.031.00.81.041.50.41.55MS1.50.61.561.50.81.572.00.42.082.00.62.092.00.82.0

2.2 藜麥愈傷組織的繼代增殖

選取生長均勻且良好的藜麥莖段愈傷組織，培養(yǎng)后觀察其生長狀況。由表3可知，6-BA是誘導愈傷組織必不可少的，其與NAA配合使用對莖段的愈傷組織誘導效果不同，6-BA 為1.5 mg/L、NAA為0.2 mg/L時莖段愈傷組織誘導率最高，處于高度分裂狀態(tài)，體積增大，結構致密，適合藜麥不定芽的誘導(見圖1-C)。根據愈傷組織的誘導情況和誘導率，選擇MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最適的繼代培養(yǎng)基。

表3 不同激素組合下藜麥的出愈率

培養(yǎng)基編號轉外植體個數愈傷數(%)愈傷誘導率(%)11200021209579.1731208974.1741208873.3351209377.50612010184.3371209982.5081208671.6791208772.50101209680.00

2.3 藜麥不定芽的誘導

將繼代培養(yǎng)后的藜麥愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進行不定芽誘導培養(yǎng)，愈傷組織在接種7 d后，開始呈現(xiàn)綠點，繼續(xù)分化培養(yǎng)20～25 d可清楚觀察到部分愈傷組織上明顯生長出不定芽(見圖1-D)，并且形成不定芽的愈傷組織明顯增多，且不定芽長勢良好。 統(tǒng)計分化率(見表4)發(fā)現(xiàn)，在6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.6 mg/L和2-IP 2.0 mg/L條件下莖段愈傷組織形成不定芽的分化率最大，圖1-D中可以看到，愈傷組織質地堅硬，淡黃色，發(fā)生褐化死亡的較少，容易分化成不定芽。通過分析藜麥愈傷組織分化形成不定芽的情況發(fā)現(xiàn)，不定芽的分化率不單與培養(yǎng)基中添加的各激素濃度有關，還與誘導愈傷組織的生長狀況相關。

注：A為莖段誘導培養(yǎng)；B為子葉誘導培養(yǎng)；C為愈傷組織誘導優(yōu)化培養(yǎng)；D為愈傷組織分化培養(yǎng)；E為生根苗；F為移栽成活的組培苗。圖1 藜麥種子組織培養(yǎng)

2.4 藜麥幼苗生根及移栽

將分化出的不定芽轉移到生根培養(yǎng)基中，30 d后藜麥組培苗生根形成完整的藜麥再生植株(見圖1-E)，可移栽至溫室大棚或室外。依據移栽季節(jié)及當地的氣候特點進行栽培管理，使組培苗逐漸適應培養(yǎng)瓶外的環(huán)境。

取出藜麥組培苗，在大棚內閉瓶煉苗10～15 d，逐步開蓋，適應外界環(huán)境，幼苗嫩葉逐漸形成蠟質層、生成表皮毛，氣孔功能完善，逐步適應環(huán)境1周后移栽至大棚。

藜麥幼苗移栽選擇低溫氣候或陰天。小心取出組培苗，洗凈根部，對根系進行消毒后用清水沖洗，移栽至營養(yǎng)土、草炭土一定比例混合的基質中。對移栽后的組培苗隨時監(jiān)測，保持周圍空氣的濕度。1周后藜麥幼苗葉片逐漸由淺綠色變?yōu)樯罹G色(見圖1-F)，主莖健壯具韌性，21 d后統(tǒng)計藜麥幼苗成活率達 95%左右。

表4 不同激素組合下藜麥不定芽的分化率

培養(yǎng)基編號接種數(塊)分化不定芽的愈傷塊數(塊)不定芽分化率(%)1301756.672301963.343302170.004302273.345302376.676302376.677302480.008302686.679302273.34

3 討 論

植物組織培養(yǎng)常選擇葉片、莖等作為外植體, 對于藜麥而言，子葉和莖段均可作為外植體成功的誘導出愈傷組織并形成再生植株，但莖段的誘導率明顯優(yōu)于其他組織[14]。藜麥組培時，實驗室培養(yǎng)、取材、接種操作便捷，不受外界環(huán)境條件的影響，同時，藜麥莖段的誘導率較高，脫分化形成再生植株所需時間較短，考慮到實驗結果的準確性和普遍性，本研究選用了藜麥的莖段作為外植體來誘導形成再生植株。同時，藜麥籽粒較小，在普通的MS培養(yǎng)基上即可以萌發(fā)生根成長，不需要添加激素，萌發(fā)率可達75%[15]。本次研究還發(fā)——藜麥種子的萌發(fā)率和儲存時間成反比。所以，通過組織培養(yǎng)促進藜麥種子萌發(fā)，而分化增殖使植株脫分化形成新的植株，縮短實驗進程，提高效益。

在組織培養(yǎng)過程中，適量的植物生長調節(jié)物質可以促進愈傷組織分化、生長和形成再生植株[16]。不同植物生長調節(jié)物誘導能力不同，不同激素濃度及組合等對植物愈傷組織的誘導及再生苗的形成產生相互影響[17]。本實驗以臺灣紅藜的莖段為外植體，選用6-BA、NAA和2-IP 3種激素配制不同激素組合對其不同階段的愈傷組織進行誘導，發(fā)現(xiàn)6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L產生的愈傷組織質地致密，誘導率較高；當激素濃度配比為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L+2-IP 2.0 mg/L時，能夠促進莖段愈傷組織分化形成不定芽，且分化率最高，藜麥不定芽形成的數量多，長勢良好。由此看出，選擇合適的激素類型及濃度對藜麥愈傷組織的誘導和分化起關鍵性作用，不同濃度的6-BA和NAA激素組合決定藜麥愈傷組織的形成和分化狀態(tài)[18]，在合適的組合協(xié)同下，成功獲得藜麥愈傷組織并分化形成再生苗。因此，在藜麥組織培養(yǎng)的不同階段，選擇適當的誘導培養(yǎng)基及激素濃度，是藜麥組織培養(yǎng)成功的關鍵因素。

藜麥愈傷組織培養(yǎng)研究取得進展的同時也存在一些問題，如試驗主要重視組培環(huán)節(jié)中最適培養(yǎng)基的篩選，而忽視對組培過程中周圍環(huán)境對試驗結果的影響。目前，藜麥組培育苗通常選擇莖段、不定芽等作為外植體，進行誘導形成再生苗，由于試驗過程中污染率高、整齊度低、成苗穩(wěn)定性差等問題，在后續(xù)的研究中如何提高藜麥種苗的質量、獲得優(yōu)質的無性種苗等，將是未來藜麥研究亟待解決的問題。同時，不同地域環(huán)境和氣候條件對藜麥的栽培產生很大的影響，因此，培育抗病抗逆性且適合貴州地域的優(yōu)良品種對拓展藜麥種植區(qū)域，培育貴州優(yōu)良藜麥新品種具有重大意義。