中藥對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響的Meta分析

，， ，

研究表明，心肌細(xì)胞凋亡由氧化應(yīng)激、負(fù)荷過重、缺血、缺氧、再灌注損傷等誘導(dǎo)[1]。凋亡也稱為程序化細(xì)胞死亡，分為內(nèi)源性和外源性兩條途徑。內(nèi)源性凋亡主要是通過調(diào)節(jié) Bcl-2 蛋白家族誘導(dǎo)的，包括Bax、Bcl-2 和Bcl-XL 等信號(hào)蛋白。caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制并通過信號(hào)通路介導(dǎo)的病理過程，阻斷其信號(hào)通路將有助于阻斷凋亡發(fā)生。中藥對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，單項(xiàng)研究結(jié)果受質(zhì)疑。筆者檢索2010年1月—2017年1月的相關(guān)文獻(xiàn)，運(yùn)用薈萃分析方法，對(duì)中藥影響心肌細(xì)胞凋亡的有效性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為臨床應(yīng)用提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 計(jì)算機(jī)檢索中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)限2010年1月—2017年1月，檢索關(guān)鍵詞“心肌損傷”“心肌缺血”“Bcl-2”“Bax”“caspase-3”。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 研究設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)，無論是否采用盲法或分配隱藏。研究對(duì)象：經(jīng)心肌損傷處理的SD或Wistar大鼠，雌雄不限。

干預(yù)措施：對(duì)照組予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組予中藥提取物或中藥針劑注射液或中藥湯劑。結(jié)局指標(biāo)：Bcl-2、Bax、caspase-3。檢測手段：蛋白檢測為Western blot法或免疫組化法，mRNA檢測為RT-PCR法。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 綜述；結(jié)局指標(biāo)不是計(jì)數(shù)；資料內(nèi)容雷同的(同一作者的不同時(shí)期文章，但數(shù)據(jù)相同)；沒有檢測方法的具體說明。

1.3 結(jié)局指標(biāo) 若研究分組包括空白組、模型組、陽性藥物對(duì)照組、中藥實(shí)驗(yàn)組低劑量組、中藥實(shí)驗(yàn)組中劑量組、中藥實(shí)驗(yàn)組高劑量組時(shí)，以模型組為對(duì)照組、中藥高劑量組為實(shí)驗(yàn)組(中藥組)進(jìn)行Meta分析。

1.4 文獻(xiàn)篩選、資料提取 由兩位研究者獨(dú)立按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)和提取資料，如遇分歧，則討論解決或交由第三方協(xié)助裁定。應(yīng)用Excel工具，自制資料提取表提取資料，提取內(nèi)容包括：納入研究的基本信息如研究題目、第一作者、發(fā)表時(shí)間，隨機(jī)方法，心肌缺血處理方法，實(shí)驗(yàn)分組情況及干預(yù)措施，結(jié)局指標(biāo)檢測的具體方法，結(jié)局指標(biāo)的數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)免費(fèi)提供的RevMan 5.3(Review Manager)專用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用均方差(MD)及其95%CI為效應(yīng)分析統(tǒng)計(jì)量，并做森林圖。首先應(yīng)用異質(zhì)性檢驗(yàn)分析各研究間的異質(zhì)性，然后選用適當(dāng)?shù)腗eta分析模型進(jìn)行計(jì)算與推斷。納入研究結(jié)果間的異質(zhì)性分析采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為P=0.1，即P≥0.1 0時(shí)，納入研究間無異質(zhì)性時(shí)，采用固定效應(yīng)模型(Fixed Effect Model，F(xiàn)EM)；P<0.10時(shí)，納入研究間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型(Random Effect Model，REM)，并結(jié)合I2定量判斷異質(zhì)性的大小。Meta分析的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 通過檢索初檢出110篇文獻(xiàn)，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)題目、摘要、全文，獲取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的19篇文獻(xiàn)。

2.2 納入文獻(xiàn)的基本情況(見表1)

2.3 Meta分析結(jié)果

2.3.1 Bcl-2通過Western blot法檢測及免疫組化法檢測Meta分析結(jié)果 對(duì)Bcl-2的5項(xiàng)研究通過Western blot法檢測，6項(xiàng)研究通過免疫組化法檢測。詳見圖1。各研究間異質(zhì)性檢驗(yàn)：χ2=8 472.23，自由度為10，P<0.000 01，表明11項(xiàng)研究不具有同質(zhì)性，故應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)量。合并效應(yīng)量MD=0.46，95%CI[0.25，0.67]，即MD的95%CI上下限均>0，表明11項(xiàng)研究的合并效應(yīng)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并效應(yīng)檢驗(yàn)：Z=4.36(P<0.000 1)，表明Bcl-2中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 Bax通過Western blot法檢測及免疫組化法檢測Meta分析結(jié)果 對(duì)Bax3項(xiàng)研究通過Western blot法檢測，5研究通過免疫組化法檢測。詳見圖2。各研究間異質(zhì)性檢驗(yàn)：χ2=3 048.07，自由度為7，P<0.000 01，表明8項(xiàng)研究不具有同質(zhì)性，故應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)量。合并效應(yīng)量MD=-0.46，其95%CI[-0.60，-0.32]，即MD的95%CI上下限均<0，表明8項(xiàng)研究的合并效應(yīng)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并效應(yīng)檢驗(yàn)：Z=6.55(P<0.000 01)，表明Bax中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 caspase-3通過Western blot法檢測及免疫組化法檢測Meta分析結(jié)果 對(duì)caspase-3的7項(xiàng)研究通過Western blot法檢測1項(xiàng)研究通過免疫組化法檢測。詳見圖3。各研究間異質(zhì)性檢驗(yàn)：χ2=595.19，自由度為7，P<0.000 01，表明8項(xiàng)研究不具有同質(zhì)性，故應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)量。合并效應(yīng)量MD=-0.37，95%CI[-0.50，-0.23]，即MD的95%CI上下限均<0，表明8項(xiàng)研究的合并效應(yīng)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并效應(yīng)檢驗(yàn)：Z=5.33(P<0.000 01)，表明caspase-3中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 納入文獻(xiàn)的基本情況

(續(xù)表1)

納入研究心肌損傷處理方式研究對(duì)象及樣本量結(jié)局指標(biāo)的檢測方法組別結(jié)局指標(biāo) 蛋白蛋白高秋等[]阿霉素致心肌損傷普通級(jí)雄性大鼠只免疫印跡法檢測蛋白對(duì)照組±±模型組±±姜黃素低劑量±±姜黃素中劑量±±姜黃素高劑量±± 羅衛(wèi)民等[]阿霉素致心肌損傷大鼠只實(shí)時(shí)定量檢測對(duì)照組±±阿霉素模型組±±金櫻子低濃度組±±金櫻子中濃度組±±金櫻子高濃度組±± 蛋白蛋白王俊東等[]結(jié)扎左前降支清潔級(jí)大鼠,雌雄各半 法檢測蛋白,半定量法檢測空白組±±±±模型組±±±±人參皂苷治療組±±±± 蛋白(‰) 蛋白(‰)宋春華等[]異丙腎上腺素雄性大鼠只免疫組化法檢測蛋白空白組±±模型組±±三七苦碟子提取物低劑量±±三七苦碟子提取物中劑量±±三七苦碟子提取物高劑量±±陽性對(duì)照組丹參滴丸±±蛋白()蛋白()桂裕江等[]異丙腎上腺素雄性大鼠只免疫組織化學(xué)染色法檢測蛋白生理鹽水組±±異丙腎上腺素組±±復(fù)方丹參片組±±心腦脈絡(luò)復(fù)元湯組±±蛋白蛋白蛋白史丹利[]去甲腎上腺素雄性大鼠只 法檢測蛋白正常對(duì)照組±±±模型組±±±黃連素低劑量組±±±黃連素中劑量組±±±黃連素高劑量組±±±

(續(xù)表1)

納入研究心肌損傷處理方式研究對(duì)象及樣本量結(jié)局指標(biāo)的檢測方法組別結(jié)局指標(biāo)蛋白鄧純[]異丙腎上腺素大鼠只只, 法檢測正常對(duì)照組±模型組±黃芪甲甙低劑量組±黃芪甲甙高劑量組± 蛋白金娟等[]阿霉素雄性大鼠只,每組選取只 法檢測蛋白,法檢測正常對(duì)照組±±模型組±±中藥對(duì)照組±±西藥對(duì)照組±±參芪益心方高劑量組±±參芪益心方低劑量組±± () () 曹麗梅等[]阿霉素級(jí)雄性大鼠只法檢測空白組±±±模型組±±±參附注射液組±±±人參附子∶組±±±人參附子∶組±±±人參附子∶組±±± (×) (×)蛋白曹旭丹等[]結(jié)扎冠狀動(dòng)脈級(jí)雄性大鼠只,每組只,隨機(jī)取只法測定, 法檢測蛋白假手術(shù)組±±±模型組±±±低劑量預(yù)處理組±±±中劑量預(yù)處理組±±±高劑量預(yù)處理組±±±蛋白蛋白劉斌等[]阻斷左前降支大鼠只,雌雄不限免疫組化法檢測蛋白組假手術(shù)組±±組缺血再灌注±±組銀杏葉提取物±±蛋白蛋白朱智德[]異丙腎上腺素清潔級(jí)雄性大鼠 法檢測蛋白(=)正常對(duì)照組±±模型組±±養(yǎng)心通脈方低劑量組±±養(yǎng)心通脈方高劑量組±±蛋白蛋白鄭思道等[]結(jié)扎左前降支級(jí)雄性大鼠只免疫組化法檢測蛋白對(duì)照組 ± ± 模型組 ± ± 治療組(參附) ± ±

圖1 中藥組與模型組Bcl-2 Meta比較的分析結(jié)果

圖2中藥組與模型組 Bax比較的Meta分析結(jié)果

圖3 中藥組與模型組caspase-3比較的Meta分析結(jié)果

2.3.4 BaxmRNA檢測結(jié)果Meta分析 對(duì)Bax 7項(xiàng)研究通過PCR檢測。詳見圖4。各研究間異質(zhì)性檢驗(yàn)：χ2=438.00，自由度為6，P<0.000 01，表明7項(xiàng)研究不具有同質(zhì)性，故應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)量。合并效應(yīng)量MD=-0.07，其95%CI為[-0.09，-0.05]，即MD的95%CI上下限均<0，表明7項(xiàng)研究的合并效應(yīng)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并效應(yīng)檢驗(yàn)：Z=6.00(P<0.000 01)，表明Bax mRNA中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 中藥組與模型組Bax mRNA檢測結(jié)果的Meta分析

2.3.5 caspase-3 mRNA檢測Meta分析結(jié)果 3項(xiàng)研究通過RT-PCR法檢測。詳見圖5。各研究間異質(zhì)性檢驗(yàn)：χ2=203.99，自由度為2，P<0.000 01，表明3項(xiàng)研究不具有同質(zhì)性，故應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)量。合并效應(yīng)量MD=-0.30，其95%CI為[-0.61，0.02]，即MD的95%CI上下限均<0，表明3項(xiàng)研究的合并效應(yīng)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并效應(yīng)檢驗(yàn)：Z=1.84(P=0.04)，表明caspase-3mRNA中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 中藥組與模型組caspase-3 mRNA檢測結(jié)果比較的Meta分析

2.3.6 Bcl-2 mRNA檢測 meta分析結(jié)果 各研究間異質(zhì)性檢驗(yàn)：χ2=728.29，自由度為6，P<0.000 01，表明7項(xiàng)研究不具有同質(zhì)性，故應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)量。合并效應(yīng)量MD=0.08，其95%CI為[0.06，0.10]，即MD的95%CI上下限均>0，表明7項(xiàng)研究的合并效應(yīng)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合并效應(yīng)檢驗(yàn)：Z=7.76(P<0.000 01)，表明Bcl-2中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖6。

圖6中藥組與模型組Bcl-2mRNA檢測結(jié)果的Meta分析

3 討 論

心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷造成的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌損傷和心功能下降的重要原因。心肌細(xì)胞凋亡在心臟重塑及心力衰竭的病理生理過程中扮演了重要角色，減少心肌細(xì)胞凋亡能改善心功能，改善心臟重塑過程[21]。

Bcl家族作為一組結(jié)構(gòu)相似、與線粒體膜穩(wěn)定性密切相關(guān)的家族蛋白，其中Bcl-2為抗凋亡基因，Bax為促凋亡基因。有研究顯示：Bcl-2∶Bax<1∶2時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡，反之則細(xì)胞存活。Bcl-2 蛋白是內(nèi)源性凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，它通過維持線粒體膜的穩(wěn)定性抑制凋亡，已被證明與細(xì)胞凋亡水平相關(guān)[22]。caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，Bcl-2通過抑制其激活而發(fā)揮抗凋亡作用[23]。

中藥對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)caspase-3，抑制缺血再灌注引起的凋亡而發(fā)揮作用。但單項(xiàng)研究結(jié)果受到質(zhì)疑。本研究通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，中藥在抑制心肌細(xì)胞凋亡中，3項(xiàng)重要指標(biāo)Bcl-2、Bax、caspase-3中藥組均優(yōu)于模型組。Bcl-2的Western blot法檢測MD=0.64(P<0.000 01)，95%CI為[0.40，0.88]；免疫組化法檢測MD=0.12(P<0.000 01)，95%CI為[0.04，0.19]；Bcl-2 mRNA結(jié)果MD=0.08(P<0.000 01)，95%CI為[0.06，0.10]。Bax的Western blot法檢測MD=-0.81(P<0.000 01)，95%CI為(-1.40，-0.22)免疫組化法檢測MD=-0.11(P<0.000 01)，95%CI為[-0.17，-0.04]；Bax mRNA結(jié)果MD=-0.07(P<0.000 01)，95%CI為[-0.09，-0.05]。caspase-3的Western blot法檢測MD=-0.40(P<0.000 01)，95%CI為[-0.56，-0.24]；免疫組化法檢測MD=-0.18(P<0.000 01)，95%CI為[-0.20，-0.16]；caspase-3 mRNA結(jié)果合并效應(yīng)量MD=-0.30(P<0.000 01)，95%CI為[-0.61，0.02]。表明中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)Meta分析可以初步表明，中藥通過對(duì)凋亡相關(guān)基因指標(biāo)的調(diào)節(jié)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡起到抑制作用，然而，Meta分析本身存在一定的局限性，有待于更多大規(guī)模、多中心的RCT文獻(xiàn)入選，以提高薈萃分析的可信度，為指導(dǎo)臨床用藥提供更好的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。