ApoE通過影響mir-30a-5p調(diào)控BDNF表達(dá)

臧貴勇， 潘開昌， 龍友國， 余躍生， 李成朋， 官志忠， 禹文峰

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病，AD的臨床特征為漸進(jìn)性的記憶-認(rèn)知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀；病理特征包括神經(jīng)元外的淀粉樣斑塊、神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和大量神經(jīng)元丟失[1]。目前對AD致病機(jī)制的認(rèn)識，多來自于對家族性AD的研究，家族性AD患者攜帶有APP、PS1或PS2的基因突變，這些基因都和Aβ的產(chǎn)生有關(guān)[2]。而對于占AD患者總數(shù)90%以上的散發(fā)性AD，遺傳學(xué)研究表明其致病機(jī)制要復(fù)雜許多[3]。迄今為止，大量的全基因組關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)找到了幾百個散發(fā)性AD的風(fēng)險(xiǎn)基因，其中ApoE[4,5]和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)[6]的突變被反復(fù)證實(shí)和散發(fā)性AD高度相關(guān)。ApoE有3種不同的基因型：ApoE2(cys112，cys158)、ApoE3(cys112，arg158)和ApoE4(arg112，arg158)，其中ApoE3在人群中的基因頻率最高，約占70%，而ApoE4約占14%[7]。ApoE3在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用，一旦突變?yōu)锳poE4以后則損害了原有的正常功能，ApoE4突變是散發(fā)性AD已知的最大的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子[8]。BDNF在海馬、皮質(zhì)和基底前腦等區(qū)域高表達(dá)，對于學(xué)習(xí)、記憶和高等思維至關(guān)重要[9]。而ApoE基因型是如何影響B(tài)DNF的表達(dá)，則存在不同的報(bào)道[10,11]，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。本文研究了在人源神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y和大鼠原代神經(jīng)元中，ApoE3和ApoE4對BDNF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 SH-SY5Y細(xì)胞購自美國ATCC(CRL-2266)；細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染所需DMEM/F12(10565-018)、MEM(12360-038)、OPTI-MEM(31985-070)、NeuroBasal(21103-049)、胎牛血清(10099141)、B27(17504044)、胰蛋白酶(15400-054)、青霉素和鏈霉素(15070063)等均購自Gibco；分子生物學(xué)中用到的限制性內(nèi)切酶與T4連接酶等購自New England Biolabs。ApoE3 (4696-1000)和ApoE4 (4699-1000)購自Bio Vision；BSA(NBP1-97058)和RAP(NBP1-78883)購自Novus Biologicals。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清和50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素的DMEM/F12，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。原代神經(jīng)元從SD大鼠的E17胎鼠皮質(zhì)組織獲得，取出大腦后分離剪碎皮質(zhì)，用0.05%胰酶在37 ℃消化7 min，用含20% FBS的MEM培養(yǎng)液終止消化，用槍頭吹打成單細(xì)胞，再用尼龍濾網(wǎng)(70 μm孔徑，F(xiàn)alcon)過濾后種在D型多聚賴氨酸(Poly-D-lysine,PDL)包被的6孔板里面。37 ℃培養(yǎng)2 h后換成Neurobasal培液。3～4 d后加入35 mg/ml的Uridine和15 mg/ml的5-Fluoro-Uridine抑制膠質(zhì)生長。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建 把人BDNF 3’UTR含有2個has-mir-30a-5p潛在結(jié)合位點(diǎn)的500 bp序列擴(kuò)增以后，插入到pMIR-report質(zhì)粒中。在野生型質(zhì)粒(pMIR- WT BDNF)的基礎(chǔ)上構(gòu)建2個單突變位點(diǎn)質(zhì)粒(pMIR- MUT1 BDNF和pMIR-MUT2 BDNF)和一個雙突變位點(diǎn)質(zhì)粒(pMIR-double MUT BDNF)。SH-SY5Y細(xì)胞用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒。48 h后用雙熒光素檢測系統(tǒng)(Promega E1910)檢測熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞分組 細(xì)胞按1×105個/ml接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞長滿70%～80%時(shí)分別加入BSA或ApoE(30 μg/ml)，或用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染hsa-miR-30a-5p mimics、NC mimics、hsa-miR-30a-5p inhibitor和NC inhibitor(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，終濃度為50 nmol)。培養(yǎng)48 h后，ELISA檢測培養(yǎng)液中BDNF的濃度，并提取細(xì)胞的總RNA和總蛋白。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 對于BDNF mRNA定量，取2 μg總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)操作說明合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參對照，引物(見表1)；PCR條件95 ℃ 3 min→(95 ℃ 30 s→60℃ 30 s)×40個循環(huán)。對于hsa-mir-30a-5p定量，用Taqman microRNA試劑盒(ABI)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參；PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45個循環(huán)。所有樣本設(shè)3個重復(fù)孔，通過熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2-△△Ct 相對定量法比較目的基因的表達(dá)差異。

1.6 Western blot檢測 取20 μg蛋白樣品變性后經(jīng)15% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。兔多克隆BDNF抗體(1∶1000,EPR1292,abcam);鼠單抗隆Actin抗體(1∶5000,ab6276,abcam)4 ℃搖床孵育過夜，分別用山羊抗兔二抗(1∶10000,Thermo)和山羊抗鼠二抗(1∶10000,Thermo)室溫孵育2 h，發(fā)光自顯影，分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 APOE3增加而APOE4減少BDNF表達(dá) 在人SH-SY5Y細(xì)胞系和大鼠原代神經(jīng)元中，ApoE3可以增加細(xì)胞內(nèi)BDNF的mRNA和蛋白水平，提高培養(yǎng)基中的BDNF濃度。而ApoE4則作用相反，它減少了BDNF的表達(dá)。同時(shí)，ApoE對于BDNF表達(dá)的影響可以被ApoE受體的阻斷劑RAP(200 nM)所阻斷(見圖1)。

2.2 人BDNF是mir-30a-5p的靶基因 與Control組相比，ApoE3降低而ApoE4增加了mir-30a-5p的水平；同時(shí)，RAP(200 nM)可以阻斷ApoE對于mir-30a-5p表達(dá)的影響(見圖2A)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，在轉(zhuǎn)染了pMIR報(bào)告質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞中，mir-30a-5p可以抑制BDNF的3’UTR活性(見圖2B)。同時(shí)，在SH-SY5Y細(xì)胞中，mir-30a-5p可以以劑量依賴的方式降低BDNF的mRNA(見圖2C)和蛋白水平(見圖2D)。

2.3 mir-30a-5p參與了ApoE對BDNF表達(dá)的影響與Control組相比 ApoE3可以增加細(xì)胞內(nèi)BDNF的mRNA(見圖3A)和蛋白水平(見圖3C)，提高培養(yǎng)基中的BDNF濃度(見圖3E)。而mir-30a-5p mimic可以阻斷ApoE3的效果(見圖3A、C、E)；ApoE4可以減少細(xì)胞內(nèi)BDNF的mRNA(見圖3B)和蛋白水平(見圖3D)，減少培養(yǎng)基中的BDNF濃度(見圖3F)。而mir-30a-5p inhibitor可以阻斷ApoE4的效果(見圖3B、D、F)。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段長度

注：人SH-SY5Y細(xì)胞中ApoE3和ApoE4對BDNF的mRNA(A),蛋白(C)和培養(yǎng)基濃度(E)的影響。大鼠原代神經(jīng)元中ApoE3和ApoE4對BDNF的mRNA (B),蛋白(D)和培養(yǎng)基濃度(F)的影響。與Control組相比*P< 0.05, ***P<0.01；與未加ApoE阻斷劑RAP組相比，n.sP<0.05

圖1 ApoE3和ApoE4對BDNF表達(dá)的影響

注：A.SH-SY5Y細(xì)胞中ApoE對hsa-mir-30a-5p水平的影響;B.hsa-mir-30a-5p對BDNF 3’UTR luciferase活性的影響;SH-SY5Y細(xì)胞中hsa-mir-30a-5p對ApoE的mRNA(C)和蛋白(D)水平的影響。與Control組相比*P<0.05,***P<0.01；與未加ApoE阻斷劑RAP組相比,n.sP<0.05

圖2 hsa-miR-30a-5p負(fù)調(diào)控BDNF的表達(dá)

注：mir-30a-5p mimic阻斷ApoE3對BDNF的mRNA(A)、蛋白(C)表達(dá)和培養(yǎng)基中BDNF濃度(E)的促進(jìn)效果;mir-30a-5p inhibitor阻斷ApoE4對BDNF的mRNA(B)、蛋白(D)表達(dá)和培養(yǎng)基中BDNF濃度(F)的抑制效果。與Control組相比*P<0.05, ***P<0.01；與NC組相比，n.sP<0.05

圖3 mir-30a-5p參與了ApoE對BDNF表達(dá)的影響

3 討 論

ApoE4是迄今為止唯一能被廣泛重復(fù)的散發(fā)性AD風(fēng)險(xiǎn)基因[8]。與ApoE4的非攜帶者相比，攜帶2個ApoE4的個體患AD的風(fēng)險(xiǎn)將增加20倍。ApoE4可以促進(jìn)Aβ產(chǎn)生，抑制Aβ清除，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，損害突觸可塑性，抑制突觸修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成[7]。此外，ApoE能夠以Isoform依賴的方式影響和AD高度相關(guān)的基因的表達(dá)。IDE是一種可以降解Aβ的酶，ApoE3促進(jìn)而ApoE4抑制IDE的表達(dá)[12]。BACE1是切割A(yù)PP產(chǎn)生Aβ的酶，ApoE4攜帶者的CSF BACE1水平比非攜帶者顯著上升[13]。

BDNF可以促進(jìn)神經(jīng)元存活，促進(jìn)新神經(jīng)元和突觸的生長和分化。BDNF在AD模型中顯示出治療效果，而且BDNF在AD患者腦部出現(xiàn)下降[14]，因此BDNF的表達(dá)調(diào)控對于理解AD發(fā)病機(jī)制和治療AD十分重要。研究表明BDNF的表達(dá)受到各種因素的調(diào)控。刺激介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮可以導(dǎo)致NMDA受體激活，觸發(fā)鈣流入，誘導(dǎo)BDNF表達(dá)[15]。多巴胺受體的激活也促進(jìn)BDNF在神經(jīng)元的表達(dá)[16]。某些類型的運(yùn)動可以增加腦部的BDNF合成，這可能是運(yùn)動可以改善認(rèn)知功能的一個原因[17]。豐富環(huán)境可以增加視覺、物理和認(rèn)知刺激等多模式刺激，顯著增加BDNF的表達(dá)，并增強(qiáng)突觸形成和神經(jīng)發(fā)生，提高學(xué)習(xí)-記憶能力[18]。

最近有研究顯示ApoE3可以增加而ApoE4減少BDNF的表達(dá)，這種相反的調(diào)控通過影響HDAC來實(shí)現(xiàn)[10]。BDNF是HDAC的靶基因之一，ApoE4促進(jìn)HDAC進(jìn)入細(xì)胞核抑制BDNF的表達(dá)；ApoE3阻止HDAC進(jìn)核而上調(diào)了BDNF的表達(dá)。這一結(jié)果得到了部分文獻(xiàn)的支持[19,20]。然而也有研究表明ApoE3和ApoE4對BDNF的表達(dá)沒有明顯的影響[11]。因此ApoE3和ApoE4是否影響B(tài)DNF的表達(dá)，仍然需要進(jìn)一步研究。

我們的研究顯示，在人神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y和大鼠原代神經(jīng)元中，ApoE3促進(jìn)而ApoE4抑制BDNF的表達(dá)。這一方面證實(shí)了過去的研究結(jié)果，另一方面提示對于ApoE4攜帶者，BDNF補(bǔ)充療法可能取得更好的治療效果。同時(shí)我們研究了ApoE影響B(tài)DNF表達(dá)的分子機(jī)制。有研究表明hsa-mir-30a-5p可以抑制BDNF的表達(dá)[21,22]。我們通過生物信息學(xué)預(yù)測，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等方法證實(shí)了BDNF是hsa-mir-30a-5p的靶基因。而且ApoE3抑制而ApoE4提高了mir-30a-5p水平，mir-30a-5p又進(jìn)一步影響了BDNF的表達(dá)。這為ApoE影響B(tài)DNF表達(dá)提供了一種新穎的分子機(jī)制。

本研究在細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞系和大鼠原代神經(jīng)元中證實(shí)了ApoE3促進(jìn)而ApoE4抑制BDNF的表達(dá)。而且我們發(fā)現(xiàn)了一個新穎的mir-30a-5p介導(dǎo)的BDNF調(diào)控機(jī)制。這為更好的研究ApoE-BDNF相互作用和理解AD的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。