TLR4的表達在急性缺血性腦血管病中作用的研究

王 辰， 秦麗微， 秦麗紅， 關雪蓮， 石 磊， 王秀萍， 侯麗淳

在急性缺血性腦血管疾病中，炎癥免疫反應在發(fā)病機制中有著重要的作用。在炎性反應所致腦損傷的過程中會有炎癥細胞的增加、細胞因子表達上調、細胞間黏附分子表達增加等反應。先天性免疫系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷中有著重要的作用,是由TLR家族直接介導的[1]。在TLR成員中,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關系較為密切是TLR4。因此,本研究通過檢測急性腦梗死患者外周血單核細胞TLR4的表達，用ELISA法測定血清TNF-α、IL-6 的濃度,探討TLR4在急性缺血性腦血管疾病中炎性損傷作用，為今后在臨床上治療急性腦梗死提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象的選取 收集佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科發(fā)病第3天急性腦梗死患者60例。收錄所有患者均符合1995年全國第四屆腦血管病學術會議制定的診斷標準,并且為CT或MRI所證實。為避免對實驗結果的干擾，有下列情況之一者會被排除：(1)正在使用激素或一個月內(nèi)使用過；(2)急性肝缺血病變；(3)急性心機缺血病變；(4)結締組織病者；(5)2 w以內(nèi)發(fā)生感染性疾病者；(6)不能按照實驗標準完成指標采集者；收集腦動脈粥樣硬化患者50例作動脈粥樣硬化組，所有病例均經(jīng)過頸部彩色多普勒檢查所證實；同時期收集佳木斯大學附屬第一醫(yī)院健康體檢者50例作為正常對照組；3組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義。所有入組人群經(jīng)過我院醫(yī)學倫理委員會批準并均簽署知情同意書。

1.2 標本采集及處理 取靜脈血之前需禁食12 h以上，空腹清晨時采取靜脈血10 ml，以乙二胺四乙酸二鉀鹽抗凝。8 ml樣品以每分鐘250 g離心5 min，吸出血漿后加入等量的0.9%氯化鈉，混均勻，選用聚蔗糖-泛影葡胺液(Ficoll分層液)分離得到單核細胞，余2 ml室溫下凝固后分離血清，零下25 ℃下冷凍備用。

1.3 RT-PCR 采用Trizol一步法提取外周血單核細胞內(nèi)總RNA，取樣品細胞,加TRLzol 500～750 μl，裂解細胞,并保護RNA防止降解，室溫下用注射器將裂解液反復抽提30次，將細胞充分搗碎后,靜置5～10 min。加入200 μl氯甲烷，劇烈震蕩15 s。靜置5～10 min，萃取裂解液中的RNA，1200 r/min離心15 min，吸取水相250 μl，加等量的異丙醇混勻，靜置5 min，濃縮沉淀RNA，1200 r/min離心15 min，棄上清，即提到了細胞內(nèi)總RNA。然后經(jīng)脫氧核糖核酸酶I(DNaseⅠ)處理。逆轉錄反應我們按照試劑盒說明書進行。TLR4 引物設計，上游引物為：5’TGG ATA CGT TTC TTA TAA 3’；下游為：5’GAA ATG GAG GCA CCC CTT 3’。采用上海博亞生物技術有限公司設計的內(nèi)參β-actin，上游引物為：5’GGG ACC TGA CTG ACT ACC TCA3’；下游引物為：5’CAA GAA AGG GTG TAA CGC AAC3’。TLR4 與內(nèi)參β-actin同管擴增，PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，54.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃終末延伸10 min。

1.4 血清IL-6、TNF-α濃度測定 實驗室采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。分別按照TNF-α、IL-6試劑盒上的說明書進行檢測。

2 結 果

2.1 TLR4 mRNA表達、血清TNF-α和IL-6濃度 TLR4 mRNA表達在急性腦梗死組為(1.35±0.23)、動脈硬化組為(0.52±0.18)、正常對照組為(0.21±0.09)，急性腦梗死組明顯高于動脈硬化組(P<0.01)，后者又高于正常對照組(P<0.01)；急性腦梗死組血清TNF-α濃度為(51.81±7.51)、IL-6濃度為(198.75±26.51)，均明顯高于動脈硬化組和對照組(P<0.01)(見表1)。

2.2 相關性分析 急性腦梗死組單核細胞TLR4 mRNA 表達與血清濃度TNF-α呈正相關,相關系數(shù)0.781(P<0.01)，TLR4 m RNA 表達與血清濃度IL-6呈正相關,相關系數(shù) 0.831(P<0.01)。

表1 3組TLR4 mRNA表達水平，血清 TNF-α和IL-6濃度

與動脈粥樣硬化組比較#P<0.01；與正常對照組比較*P<0.01

3 討 論

腦梗死發(fā)病機制比較復雜,目前也不是完全清楚，既往我們認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)是免疫反應豁免器官,但現(xiàn)在逐漸認識到在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)也同樣存在免疫監(jiān)視。炎癥免疫反應存在于腦梗死壞死及缺血區(qū)域,導致炎性損傷，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[2,3]。作為啟動機體先天性免疫應答的開關,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。在TLR成員中,TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮關鍵作用,小膠質細胞則是損傷介質的主要來源[4]。TLR4廣泛分布在腦室周圍血管叢、小膠質細胞、星型膠質細胞[5]。而腦缺血病理損傷中小膠質細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞是炎性細胞因子產(chǎn)生的主要來源。TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮關鍵作用。但在腦梗死炎癥損傷中的作用機制目前尚不明了，目前在腦梗死炎癥損傷中的作用機制卻報道不多。炎性反應是神經(jīng)元毒性的關鍵環(huán)節(jié)，腦梗死后第3天,在腦梗死缺血區(qū)域達到高峰[6]。因此我們選擇了發(fā)病3 d的腦梗死患者作為研究對象，這樣炎癥反應比較典型。

TLR4表達會受到某些疾病的影響，比如結締組織病、近期的感染、心肌缺血、梗死、肝缺血等，因此入組條件排除了這些患者,入組的急性腦梗死患者絕大多數(shù)是動脈粥樣硬化型，為避免動脈粥樣硬化對表達TLR4的影響,我們選擇無腦梗死的動脈粥樣硬化患者為對照組。本研究檢測了腦梗死組、動脈硬化組、健康組TLR4的表達變化、細胞因子TNF-α、IL-6濃度，以及它們之間的相關性。結果我們發(fā)現(xiàn)急性腦梗死組較其他兩組mRNA的表達、TNF-α、IL-6濃度明顯增高,有明顯統(tǒng)計學意義。mRNA與血清TNF-α、IL-6濃度呈正相關，急性腦梗死時內(nèi)環(huán)境缺血缺氧，血管內(nèi)皮通透性增加，致使腦組織壞死物質釋放,包括HSP70、高遷移率蛋白-1等，它們是TLR內(nèi)源性配體，吸引單核/巨噬細胞、淋巴細胞趨化聚集,成為加劇炎性損傷的效應細胞,這些細胞均有豐富的TLR 4表達。TLR 4mRNA表達上調促使炎性因子產(chǎn)生分泌增多，并在腦梗死的病理過程中參與炎癥反應。TNF-α、IL-6作為炎性損傷細胞因子中的典型代表，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎性反應中起著重要作用,可以作為炎性程度的參考指標。本實驗研究已證實腦梗死急性期血清TNF-α、IL-6因子濃度較動脈硬化組及健康組明顯增高，并且發(fā)現(xiàn)mRNA與血清TNF-α、IL-6濃度呈正相關，提示TLR4在急性腦梗死中作為信號轉導的炎性受體，誘發(fā)了細胞因子的產(chǎn)生，參與到急性腦梗死的發(fā)病機制中的炎癥反應過程。

研究發(fā)現(xiàn)[7]，敲出小鼠TLR4后，TLR4缺陷小鼠的腦梗死面積、腦水腫面積及神經(jīng)功缺損評分均明顯低于對照組，說明TLR4在急性腦梗死中發(fā)揮著重要作用,TLR4缺陷降低了急性腦梗死損傷，也許是通過減少炎性因子的產(chǎn)生來減輕腦梗死的炎癥反應?？赡苡蒚LR2和TLR4識別以啟動炎癥反應。有學者認為[8]發(fā)現(xiàn)在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后周圍區(qū)域的腦皮質中,TLR4表達明顯升高,NF-κB、促炎癥細胞因子IL-1、TNF-α、細胞間黏附分子-1明顯上調。文獻報道[9,10]探討了髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,Myd88)在信號通路中所起的作用,Myd88是TLR通路中的一個關鍵接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。低溫制作的創(chuàng)傷動物模型在腦組織損傷24 h后細胞炎性因子濃度明顯升高。而在對照組(Myd88缺失的小鼠)免疫反應減弱,腦組織損害較輕。但具體的有關機制及信號傳導在炎癥中的作用尚不完全明白。機制目前分析可能是啟動胞內(nèi)信號轉導，通過c-Jun氨基末端激酶/應急激活的蛋白酶(JNK/SAPK)兩條途徑來激活炎性細胞,繼而IL-6、TNF-α等炎性因子的大量表達,觸發(fā)一系列瀑布炎性反應，具體上游、下游關鍵分子及具體機制仍有待繼續(xù)研究明確。

TLR作為啟動機體天然免疫應答的開關,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要的作用。在急性腦梗死患者中，為阻止的TNF-α、IL-6等炎性因子的毒性效應，我們可否使用合理的臨床手段暫時阻止TLR4的表達，其研究前景廣闊，有助于腦梗死發(fā)病機制的深入研究，也為目前臨床治療急性腦梗死提供新的補充。