辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)急性心肌缺血大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

雷杰，段剛峰，鄭瓊莉

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

心肌缺血是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)的病理狀態(tài)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化或痙攣是其主要病因，急性發(fā)作死亡率高。CHD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康[1]。中醫(yī)學(xué)將冠心病歸屬于“胸痹”等證范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就記載了“心病先心痛”“真心痛，手足青至節(jié)……旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死”。漢代醫(yī)家張仲景詳細(xì)論述胸痹的病因病機(jī)，首創(chuàng)胸痹的辨證論治，指出“夫脈當(dāng)取太過(guò)不及，陽(yáng)微陰弦，即胸痹而痛”，明確了病機(jī)為“陽(yáng)微陰弦”，即陽(yáng)氣不通，痰瘀痹阻心脈，并創(chuàng)立了瓜蔞薤白半夏湯、枳實(shí)薤白桂枝湯等辛溫通陽(yáng)的代表方，而薤白、附子、干姜、桂枝則是辛溫通陽(yáng)的代表中藥。前期研究證實(shí)[2-5]，辛溫通陽(yáng)中藥能降低血清C反應(yīng)蛋白(CRP)和一氧化氮(NO)水平、減少血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)含量、清除血清超氧化物歧化酶(SOD)、MDA，增加心肌灌注等作用。受仲景思想之啟迪，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)心肌缺血損失的認(rèn)識(shí)，本課題組擬復(fù)制急性心肌缺血大鼠模型，探討辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)模型大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為心血管疾病的治療提供新思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠(SPF級(jí))70只，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：HNASLKJ20100977。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

2.6%薤白提取物混懸液(批號(hào)091101)、1.9%桂枝提取物混懸液(批號(hào)091105)、0.9%干姜提取物混懸液(批號(hào)091009)、3.2%附子提取物混懸液(批號(hào)091103)(什邡市巨邦植物原料有限公司)；1.6%硝酸甘油混懸液(批號(hào)905028KL，齊魯制藥有限公司)；無(wú)水乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、4%多聚甲醛、二甲苯(武漢宇陽(yáng)鋒銳生物科技有限公司)；戊巴比妥鈉(批號(hào)30037523，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；0.9% NaCl溶液(批號(hào)20130126，山東康寧藥業(yè)有限公司)；T-AOC、GSH-Px、MDA、MPO測(cè)試盒，IL-10、IL-6、TNF-α Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ECG-6951D型心電圖機(jī)(上海光電子儀器有限公司)；XSP-BM-30AC電腦型生物顯微鏡(上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司)；16C14型721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Tekmar組織勻漿機(jī)(美國(guó)Teledyne Tekmar公司)；powerlab/8s型八導(dǎo)數(shù)據(jù)分析儀(澳大利亞埃德公司)；MDF-390ATYO超低溫冰箱(日本SANYO公司)；HX200型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(成都春盟科技有限公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

70只大鼠用隨機(jī)數(shù)表分為7組，每組10只：假手術(shù)組、模型組、薤白組、附子組、干姜組、桂枝組、硝酸甘油組。

2.2 模型制備

大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行腹腔注射麻醉(3.5%戊巴比妥鈉，35 mg/kg)，仰位固定，將大鼠與數(shù)據(jù)分析記錄儀(powerlab/8s型)連接好，記錄一段正常心電圖后開(kāi)胸。隨后將大鼠氣管切開(kāi)插管，連接動(dòng)物微量呼吸機(jī)(10×60 ml/min持續(xù)進(jìn)氣)，通過(guò)開(kāi)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，復(fù)制急性心肌缺血模型。具體如下：胸部去毛，消毒，沿左胸骨中線(xiàn)切開(kāi)線(xiàn)形皮膚口約2 cm，于第4肋間開(kāi)胸，擴(kuò)胸，去掉心包膜，暴露出心臟，在左冠狀動(dòng)脈起始下約2 cm(即左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐交界處)，用細(xì)線(xiàn)結(jié)扎(假手術(shù)組只置手術(shù)線(xiàn)而不結(jié)扎)。心電監(jiān)護(hù)見(jiàn)Ⅱ?qū)?lián)提示ST段顯著抬高，證明結(jié)扎成功。

2.3 給藥方法

造模完成后，在大鼠腹部正中線(xiàn)偏左開(kāi)口，找到十二指腸，結(jié)扎5 min后，用注射器給藥，薤白組、干姜組、附子組、桂枝組按600 mg/kg給藥；硝酸甘油組按80 mg/kg給藥，假手術(shù)組和模型組給予相同體積的生理鹽水，給藥體積為2 ml/kg。

2.4 取材

給藥3 h后觀測(cè)心電圖，后立即以血管鉗暫時(shí)夾閉大鼠胸壁?？焖傩写笫蟾怪鲃?dòng)脈取血，立即將其中2 ml血注入含有10%EDTA二鈉30 μl和胰肽酶40 μl的試管中，混勻，離心(4℃，3 000 rpm 10 min)，取上清，放置于-70℃冰箱中保存待測(cè)。取血完成后立即取下大鼠心臟置于冰生理鹽水里，洗凈心臟組織，剪取左心室心尖組織凍存，用于心肌MPO活性檢測(cè)和組織病理切片制作。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段變化

采用心電圖機(jī)標(biāo)準(zhǔn)心電圖Ⅱ?qū)?lián)檢測(cè)(標(biāo)準(zhǔn)電壓0.1 mv，走紙速度50 mm/s),分別記錄結(jié)扎前10 min與結(jié)扎后3 h心電圖ST段變化，計(jì)算ST段抬高的均數(shù)。

2.5.2 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取心尖缺血的心肌組織，將心肌組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24 h，先后用70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇梯度脫水，經(jīng)二甲苯透明，再用蠟塊包埋，最終制成石蠟切片(5 μm)，行HE染色，觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5.3 大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

GSH-Px活性測(cè)定采用比色法；MDA水平測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；T-AOC活性測(cè)定采用鐵還原法。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5.4 大鼠炎癥因子的測(cè)定

采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)大鼠血清IL-10、IL-6及TNF-α水平。MPO活性測(cè)定方法如下：將心肌組織稱(chēng)重,按1∶18的重量體積比，加勻漿遞質(zhì)，制成勻漿(5%),然后加入顯色劑、H2O2，水浴后馬上在分光光度計(jì)460 nm處測(cè)定A值。具體操作步驟參照MPO測(cè)試盒說(shuō)明。MPO以37℃反應(yīng)體系中H2O2被分解1 μmol為1個(gè)活力單位。

MPO(IU/g)=(測(cè)定管A值-對(duì)照管A值)/11.3×取樣量(g)

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠急性心肌缺血損傷心電圖ST抬高水平的比較

與假手術(shù)組比較，模型組ST段上移明顯，提示造模成功；與模型組比較，中藥組與西藥組ST段抬高均顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01) ，提示各辛溫通陽(yáng)中藥能減輕大鼠急性心肌缺血損傷，各藥物組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖ST段的影響

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的比較

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)完整，大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，成束排列，心肌細(xì)胞整齊，細(xì)胞核為橢圓形，位于細(xì)胞中央，肌纖維間散在毛細(xì)血管；模型組心肌纖維排列紊亂，心肌纖維斷裂、腫脹，可見(jiàn)小灶性肌纖維壞死，肌纖維間毛細(xì)血管擴(kuò)張充血伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；薤白組心肌纖維部分?jǐn)嗔?，肌纖維間毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；干姜組心肌纖維排列較為整齊，少數(shù)肌纖維斷裂，可見(jiàn)心肌細(xì)胞壞死并伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；附子組、桂枝組心肌纖維排列較為整齊，少數(shù)心肌纖維斷裂，僅見(jiàn)一部分心肌腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，肌纖維間毛細(xì)血管擴(kuò)張充血不明顯；硝酸甘油組肌纖維排列整齊，極少數(shù)肌纖維斷裂，肌纖維間少數(shù)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 各組大鼠急性心肌缺血損傷氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組T-AOC、GSH-Px的活性明顯降低 (P<0.01)，而MDA 的水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組與西藥組均能顯著升高血清T-AOC及GSH-Px 的活性(P<0.05，P<0.01)，明顯降低MDA水平(P<0.05，P<0.01)。組間比較，薤白組較其余各組T-AOC升高更顯著(P<0.05)；干姜組較其它藥物組MDA水平較高(P<0.05)，其余組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 大鼠急性心肌缺血損傷心肌細(xì)胞組織病理學(xué)觀察(HE染色，200×)

表2 辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)大鼠急性心肌缺血血清氧化應(yīng)激的影響

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 各組大鼠血清炎癥指標(biāo)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-6、TNF-α水平及MPO活性明顯升高(P<0.01)，血清IL-10顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，辛溫通陽(yáng)各組均能降低IL-6、TNF-α水平及MPO活性(P<0.05，P<0.01)，相應(yīng)地增加IL-10的水平而減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度(P<0.05，P<0.01)；組間比較，薤白組與桂枝組對(duì)IL-10升高更加明顯(P<0.05)，二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；各藥物組IL-6、TNF-α水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；附子組MPO活力較高(P<0.05)，其余組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)大鼠急性心肌缺血損傷炎癥反應(yīng)的影響

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.薤白組；D.附子組；E.干姜組；F.桂枝組；G.硝酸甘油組。圖2 辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)大鼠急性心肌缺血損傷炎癥反應(yīng)的影響

4 討論

冠心病急性心肌缺血是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，90%的發(fā)病原因是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化所引起的，結(jié)果造成心肌處于一種缺血、缺氧的病理狀態(tài)。目前認(rèn)為其機(jī)制主要包括兩個(gè)方面：1)氧化應(yīng)激[6]：氧自由基產(chǎn)生過(guò)多，清除能力下降，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，活性氧被大量產(chǎn)生，一方面直接通過(guò)氧化還原反應(yīng)損傷生物膜，另一方面間接地激活中性粒細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。在氧化應(yīng)激過(guò)程中，GSH-Px是一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可以使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能[7]。而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的一個(gè)重要指標(biāo)，MDA的產(chǎn)生會(huì)加劇細(xì)胞膜的損傷[8]。T-AOC反映出機(jī)體抗氧化能力的水平[9]。2)炎性因子[10]：炎癥可產(chǎn)生大量的NO導(dǎo)致組織損傷，進(jìn)而引起內(nèi)皮損傷，加速冠脈粥樣硬化的形成。白細(xì)胞介素又參與人體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)與表達(dá)[11]，其中IL-6可促進(jìn)炎性介質(zhì)直接作用于血管壁，改變其通透性，損害心肌組織；IL-10能夠降低促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并具有免疫抑制作用；MPO涉及到動(dòng)脈粥樣硬化的所有階段，可引起內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，與冠脈疾病密切相關(guān)[12]。TNF-α可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管損傷和血栓形成[13]。

中醫(yī)學(xué)中無(wú)急性心肌缺血的概念，據(jù)其臨床癥狀多歸屬于“心痛”“胸痹”“真心痛”等范疇?！靶乇浴辈∶滓?jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，至漢代張仲景加以豐富，明確了胸痹乃上焦陽(yáng)氣不足，下焦陰寒氣盛的本虛標(biāo)實(shí)之證，并確立了辛溫通陽(yáng)的治療大法。中醫(yī)學(xué)理論中對(duì)陽(yáng)氣較為重視，《素問(wèn)·生氣通天論》載：“陽(yáng)氣者，若天與日，失其所，則折壽而不彰”[14]。人之陽(yáng)氣就如同日光，太陽(yáng)主宰自然界生物的生長(zhǎng)發(fā)育，人之陽(yáng)氣則主宰著我們機(jī)體生命活動(dòng)的全過(guò)程。陽(yáng)氣同時(shí)又以“通”為用，葉天士言:“陽(yáng)氣窒閉，濁陰凝痞”，具體來(lái)講即是陽(yáng)氣不通，從而導(dǎo)致濁陰凝聚，痞塞壅滯[15]?！靶臑榛鹋K，燭照萬(wàn)物”，心以陽(yáng)氣用事，陽(yáng)氣不通，痰瘀痹阻則導(dǎo)致心肌缺血，針對(duì)此證，葉氏提出“通陽(yáng)必以辛熱”[16]。薤白、附子、干姜、桂枝作為辛溫通陽(yáng)中藥的代表，在心血管疾病的防治中發(fā)揮了重要作用?！侗静輬D經(jīng)》記載：“薤，味辛則散， 散則使在上寒滯消……瘀血可散，胸痹刺痛可愈。”《本草新編》言：“細(xì)辛陽(yáng)藥也……善降濁氣而升清氣?！?而桂枝又具辛溫之性，能溫通經(jīng)脈、通陽(yáng)化氣；干姜“通心助陽(yáng)”“去臟腑沉寒痼冷”，善發(fā)諸經(jīng)之寒氣[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，薤白對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用，能夠擴(kuò)張血管、 抑制凝血和抗血栓[18]。桂枝所含桂皮醛、桂皮酸鈉具有擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抗凝血作用[19]。干姜內(nèi)所含姜烯酚等活性物質(zhì)具有興奮心臟，擴(kuò)張血管，抗血小板聚集等作用[20]。附子煎劑則具有明顯的強(qiáng)心作用，能夠加強(qiáng)心肌收縮力，增加收縮幅度和頻率[21]。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)心肌缺血后的大鼠從心電圖顯示ST段明顯抬高，與模型組相比，病理形態(tài)HE染色顯示，各辛溫通陽(yáng)中藥組心肌損傷程度下降，血管擴(kuò)張和炎性浸潤(rùn)也相應(yīng)減少。從氧化應(yīng)激和炎癥因子角度分析，較模型組而言，各辛溫通陽(yáng)中藥組能顯著升高血清T-AOC及GSH-Px活力，降低MDA的水平，并能降低IL-6、TNF-α濃度及MPO活力，增加IL-10的水平從而減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，說(shuō)明辛溫通陽(yáng)中藥對(duì)急性心肌缺血大鼠具有保護(hù)作用。

綜上所述，薤白、附子、干姜、桂枝這些辛溫通陽(yáng)中藥能夠起到保護(hù)急性心肌缺血大鼠心肌損傷的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控氧化應(yīng)激，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，降低相關(guān)炎性細(xì)胞或因子的釋放有關(guān)。